小鼠肝细胞原代培养、灌注.doc

小鼠肝细胞原代培养、灌注.doc小鼠肝细胞原代培养、灌注小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享:材料:小鼠器具:饭盒、纱布、小剪子、小辍子、大銀子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50ml)>6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂:DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备:酒精擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。操作步骤:1>将小鼠断颈致死,置75%酒精泡2・3秒钟,取肝脏,置于盛有PBS的平皿中。2、 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。3、 用手术剪将脏器剪成小块(lmm2),玻片研磨,转到离心管,离心lOOOrpm,5mino4、 视组织或细胞量加入5・6倍(3・5ml)胰酶,37°C中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。5、 加入3・5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。6、用100目孔径滤网滤过,除去未消化的大组织块。7、 lOOOrpm,离心5分钟,弃上清液。8、 加入无血清培养液5rr)l,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。9、 加入含血清的培养液l・2ml(视细胞量),血球计数板计数。20、将细胞调整到5X105/ml左右,转移至6孔培养板中,37°C下培养。肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件,现分别介绍如下,首先介绍原代肝细胞的分离。目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Saigon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下:1:供体肝脏的游离:选择Mercedes手术切口,即人字型切口,进入腹腔,暴露肝脏,分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带(为了便于手术,可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引,并向两侧移动,显露膈下空间),解剖肝十二指肠韧带,确认胆总管,应尽可能靠近远心端结扎(从十二指肠后面进行)。分离肝动脉,确认胃十二指肠动脉,并将其仔细结扎,但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程,直至脾动脉、胃左动脉显露,结扎离断脾动脉、胃左动脉注射肝素lOOUo缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支,以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎,并于结扎线间将英离断,这样就可显露脾静脉与肠远心端离断肝上下腔静脉,准备肝脏灌注。迅速切除肝脏,术屮连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏,最终将肝脏在腹膜后切除,获取肝脏。之后行门静脉插管,准备行肝脏灌注,分离肝细胞。2:灌注液的配置:PerfusionSolution1(g/L):??,〜(使用pH计),,4°C保存,使用时液体温度维持在37°C(应用水浴箱)。PerfusionSolution2(g/L):??,4°C冰箱过夜,以