GPR91调控MAPK通路在糖尿病性视网膜病变中的作用.pdf

Dissertation Submitted toShanghai JiaoTong University fortheDegree ofPhilosophy Doctor DISSERTATION FOR DOCTOR DEGREE oF MEDICINE IN SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY The roleofGRP9 1indiabetic retinopathy by modulation ofMAPK signaling pathway Candidate: Supervisor: Jianyan Hu Wu Academic Degree Applied for:Doctor ofMedicine Speciality: Student ID: Af衄afion: Rearch Direction: Ophthalmology 0127259297 Sch001 ofMedicine Mechanism ofdiabetic retinopathy Degree·-Conferring··Institution: Shanghai JiaoTong University Date ofDefence: April,2015 Research Grants: National Natural Science Foundation, 300775 Key Basic Science Foundation ofScience mission ofShanghai Municipality, JC 407702 Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’S Hospital April,2015 万方数据上海交通大学博士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:窃狼丰砂日期:加心年岁月,日万方数据上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定, 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口,在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密a。(请在以上方框内打“√”) 学位论文作者签名:加迎丰秒指导教师签名:墨它日期:沙ly年r月,日H期:w心年厂月厂H 万方数据上海交通大学博士学位论文 GPR91调控MAPK通路在糖尿病性视网膜病变中的作用中文摘要目的:糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病患者最严重的微血管并发症之一,目前发病机制尚未明确。通过模拟糖尿病的体内外环境,观察G蛋白偶联受体91 (GPR91)对DR微血管病理改变的影响;探讨GPR91通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路调控VEGF的分子机制。方法:构建GPR91小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体及相应的空病毒。(1)体内实验:健康雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病模型。成模2W时玻璃体腔注射GPR91 shRNA慢病毒。气相色谱质谱联用仪检测视网膜中琥珀酸含量。注射病毒后12W,HE染色,透射电镜和依文思蓝渗漏实验观察视网膜微血管的结构及功能改变。(2)体外实验:高糖/琥珀酸/' shRNA或siRNA,Westem blot检测GPR91, P-ERKI/2,p-JNK,p-p38 MAPK,COX-2,C/EBPl3,C/EBP6,c·Fos和VEGF的表达情况;免疫荧光检测GPR91,C/EBP[5,C/; ,,C/EBP[5,C/EBP5,; ELISA检测PGE2和VEGF的分泌情况;RGC一5与RF/6A细胞共培养检测RF/6A 细胞的增殖迁移能力;荧光素酶报告系统(Luciferase)和染色质免疫共沉淀(ChIP) 检测C/EBP、APl调控VEGF的转录情况。结果:成功构建GPR91 shRNA慢病毒载体。(1)体内实验:糖尿病大鼠视网膜中琥珀酸含量较对照组增加(P<),GPR91的表达并未出现明显差异。GPR91 shRNA玻