elisa产品简析与探讨.ppt

?ELISA——酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)发展历程和应用?起源于20世纪60年代:EIH(酶免组织化学技术,1966)→EIA(酶免疫测定,1971)→McAb技术(单克隆抗体,1975)→基于ELISA技术的快速检测产品(传染病,妊娠诊断,植物疫病,农兽残等)农兽残小分子药物ELISA检测试剂盒技术原理?直接竞争法:“抢凳子”?为何能测定小分子?抗体(Antibody),又称免疫球蛋白(Immunoglobin,Ig),是一种免疫系统中鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质。仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中。抗体能识别特定外来物的一个独特特征,该外来目标被称为抗原。(“钥匙与锁的关系”)以克伦特罗试剂盒为例:包被板:包被有以半抗原(克伦特罗)经过偶联后免疫所获得的多克隆抗体;该抗体可以识别克伦特罗或者其类似物Anti-cle抗体:通过共价结合或非公价吸附到微孔板达到固相化目的(Coatingtechniques)单克隆抗体技术和多克隆抗体技术比较分析:特别说明:不同的技术平台上应用的原料虽然名称一致(比如克伦特罗的酶标和金标抗原抗体原料),但抗体的来源属性可能是不一样的。某抗体适合做酶标产品,但是可能不适合做金标产品。单抗技术特征名称单克隆抗体monoclonalantibody多克隆抗体polyclonalantibody产生1种抗原决定簇+1个效应B细胞→杂交瘤(增殖+分泌特异性抗体)多种抗原决定簇+效应B细胞或同一种抗原决定簇+不同的效应B细胞特征及优点高特异性、高均一性;批间CV小;广泛应用ELISA、WB、IP、IF、ICC、IHC(抗体的用量比较大或者需要长期使用一致的抗体)制备时间短、首次制备成本低,特异性和灵敏度取决于制备技术;识别多个抗原表位(不会影响实验结果);利用ELISA法可以检测类似物缺陷不能进行沉淀和凝集反应;反应强度不如多克隆抗体;制备技术复杂而且费时费工;无法进行多合一检测;(对于某些药物的代谢物检测上可能存在假阴性)批间CV大;交叉反应率高(特异性不强)检测(下)限和灵敏度试剂盒灵敏度:试剂盒本身的灵敏度和对某一具体样本的检测限是不一样的。试剂盒本身的灵敏度一般是指试剂盒标准品中除零标准外浓度最小的标准品浓度值。其理论定义为:测定10孔B0吸光度值,算出平均值X和标准偏差(SD),计算出3倍SD值,据公式X+3SD(X+3SD)得出的结果即为试剂盒灵敏度(一般招投标资料上要求的灵敏度即指标准曲线浓度最小值)针对样本的检测(下)限:其理论定义为:按照合理的前处理方法对20个阴性样本进行测定,算出平均检测值X和标准偏差(SD),计算出3倍SD值,据公式X+3SD得出的结果即为该样本的检测(下)限。注:文件引自农业部备案文件2010杭州迪恩克伦特罗EIAIC50半对数曲线Cubicspline拟合中监所备案采用试剂盒灵敏度和检测(下)限与曲线的关系:?以竞争法为例:~系指在酶免反应中药物产生50%抑制率时所对应的药物(标准品)?用IC50值表示(使用标准曲线浓度最低点表示缺少统一标准且混乱)(下)限的关系?一般地,灵敏度越高,检测限也就越高。在设定判断阈值(判断阴性阳性值)时,阈值应可能落在曲线斜率较大处(即形状较陡处;靠近IC50值)招标资料上的所谓灵敏度相关系数(对数曲线)半对数曲线,线性拟合大多数EXCEL软件就是使用该曲线算法相关系数变异系数(CV):体现试剂盒的稳定性和准确性。CV=SD/X※100%)相关系数(Correlationcoefficient):在概率论和统计学中称相关系数或关联系数。显示两个随机变量之间线性关系的强度和方向。试剂盒备案要求:≥:(交叉反应率)药物的交叉反应率:定义:引起50%抑制的标准物浓度与类似物引起50%抑制的浓度值之比。比如客户问:克伦特罗试剂盒/检测卡对莱克多巴***有没有交叉(能不能测)?计算公式:~=IC50CL/IC50Rac※100%意义:类似物的交叉反应率参数体现试剂盒特异性。物质名称交叉反应率(%)(1R,3R)-(1S,3R)-(1S,3S)-