基因突变敏感性分子开关在肺癌EGFR基因突变检测中的应用研究.pdf

南华大学
硕士学位论文
基因突变敏感性分子开关在肺癌EGFR基因突变检测中的应用研
究
姓名:肖莉
申请学位级别:硕士
专业:药理学
指导教师:李凯;廖端芳
20070501
基因突变敏感性分子开关在肺癌
EGFR 基因突变检测中的应用研究

中文摘要

研究生:肖莉
导师:李凯教授
廖端芳教授
专业:药理学


目的:研究高保真 DNA 聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关在肺癌
EGFR 基因缺失突变检测中的应用。
方法:选取与肺癌密切相关的 EGFR 基因 19 号外显子上的两种非移码缺
失突变 del E746–A750(del 2235–2249)和 del L747–P753 insS(del 2240–2257),即
15nt 和 18nt 缺失突变为检测靶点,分别设计 3’末端与野生型基因位点或突变基
因位点配对的引物,并硫化磷酸修饰;采用高保真 DNA 聚合酶联合 3’末端硫代
修饰的特异性引物所构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应缺失突变的阳
性质粒模板及正常人基因组 DNA 模板进行分析和方法评估。在 48℃到 68℃大
范围退火温度下,采用梯度 PCR 结合凝胶电泳,比较了有硫化修饰和无硫化修
饰引物,在高保真酶介导的缺失突变检测中的区别;比较了 Taq 酶与 Pfu 酶介导
的 3’硫化修饰特异性引物延伸反应在缺失突变检测中的特异性及可靠性。对 6
例肺癌患者的组织样品进行了筛查。采用荧光定量 PCR,评估高保真酶介导的
敏感性分子开关在荧光定量 PCR 中的敏感性和相关性。
结果:高保真酶介导的敏感性分子开关准确识别了肺癌 EGFR 基因 15nt
和 18nt 的缺失突变。在 48°C 到 68°C 大范围退火温度下,敏感性分子开关在突
变模板上得到特异性的扩增产物,而在野生模板上起到“关”的效应,特异性随
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退火温度提高而增强。重组质粒定量后,稀释成 108、107、106、105、104、103、
102、101 拷贝数/µl 浓度梯度作为阳性模板,显示敏感性分子开关在普通 PCR 结
合凝胶成像电泳中,15nt 缺失突变检测分子开关可检测的起始拷贝数为 3000 突
变分子,而 18nt 缺失突变检测分子开关敏感性更高,可检测的起始拷贝数为 10
突变分子。对照组中,采用 Taq DNA 聚合酶或 3’末端无硫代修饰的特异性引物,
均易产生假阳性且呈退火温度依赖性。将上述 15nt 缺失突变阳性模板用于制定
荧光定量 PCR 的标准曲线,结果显示,定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好
的线性关系,相关系数为 。对 6 例非小细胞性肺癌患者的肺组织样本进行
检测,发现 1 例含有 15nt 缺失突变。由于该标本体细胞突变含量较少,低于实
际序列分析所检测范围的敏感度。

结论:
(1) 高保真酶介导的基因突变敏感性分子开关除可用于点突变识别外,还可
用于识别基因序列中的小缺失突变;
(2) 高保真酶介导的基因突变敏感性分子开关与荧光定量 PCR 相结合,可用
于小缺失突变的定量分析;
(3) 高保真酶介导的基因突变敏感性分子开关可用于体细胞突变检测。

关键词:缺失突变;突变检测;EGFR;校正 PCR







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Application of mutation-sensitive molecular switch in the
detection of EGFR mutations associated with lung cancer
(Abstract)
Aim: To study the application of the mutation-sensitive molecular switch in the
two deletion hotspots of EGFR gene associated with lung cancer.
Methods: Two hotspots deletions in exon 19 of EGFR gene were chosen as the
detection targets of this research project. They are 15 nt deletion of E746–A750(del
2235–2249) and 18 nt deletion of L747–P753 insS(del 2240–2257). All