环孢素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞形态、增殖凋亡的影响.pdf

第二军医大学硕士学位论文环孢素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞形态、增殖及凋亡的影响姓名:沈頔申请学位级别:硕士专业:外科学(整形外科学) 指导教师:邢新 2011-05 环孢素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞形态、增殖及凋亡的影响-1- -1- (CsA)又名环孢菌素A,是环孢素的一种。环孢素A是一种免疫抑制剂, 最早是在1971年由柱孢弯颈霉菌(TolypocladiuminflatumGams)中被分离处理出来的。Borel在1976年发现它具有选择性的免疫抑制作用。它能够减少中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量。环孢素A目前被成功的广泛运用于器官移植后的抗排斥反应中。它是第一种选择性的T细胞抑制药。它可以将T细胞抑制在最初的G0 期而没有明显的毒副作用。环孢素A结合了细胞内的亲环素,通过细胞内信号转导抑制了Th细胞的IL-2基因的转录,从而抑制其钙神经素/钙调蛋白磷酸酶激活途径的活化。近年来的研究发现CsA除了具有强大的免疫抑制效应外还具有抗增殖作用, 适当浓度就能有效的抑制血管内皮细胞、表皮角质细胞、结膜成纤维细胞、晶状体上皮细胞等细胞的增殖。目前因为其抗增殖作用而被广泛运用于肺纤维化的治疗。肺间质纤维化是由多种病因引起的异质性疾病,其主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎和后期大量成纤维细胞的病理性增殖及胶原进行性积聚。随着对肺间质纤维化发生机制研究的不断深入,大量研究结果证实细胞因子在肺间质纤维化发生发展中起了关键作用。其中,转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβl,TGF-β1)被认为是最为关键的致纤维化因子。环孢素A对于TGF-β1的抑制作用是其治疗肺纤维化的重要依据之一。同时,由于环孢素A的抗纤维化作用,也有报道证明其能够在青光眼手术中预防纤维化并抑制人牙龈成纤维细胞的增殖。瘢痕疙瘩(keloid)是一种临床上常见的纤维组织增生性疾病,是一种皮肤对于损伤的过度反应。目前主要的治疗方法有皮损内药物注射和手术切除。但是,还没有一种方法对于所有患者都是有效果的,这主要是因为对于瘢痕疙瘩形成机理没有完全研究清楚。在瘢痕疙瘩的形成中,TGF-β1被发现是一种重要的致纤维化因子。TGF- β1是一种多功能的生长因子,几乎所有细胞都有其受体。在哺乳动物体内,TGF- 第二军医大学硕士学位论文-2- β具有三种亚型。包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β1和TGF-β2 参与瘢痕形成;TGF-β3则具有抗纤维化作用。瘢痕疙瘩成纤维细胞中TGF-β1异常升高,并且TGF-β1的mRNA及其受体表达也异常增高,这些一方面反映了瘢痕成纤维细胞对于TGF-β的高反应性,同时进一步肯定了TGF-β在瘢痕形成过程中的重要地位。目前研究表明,TGF-β1主要依赖Smad蛋白家族的信号传导通路发挥作用。参与信号转导的Smad是一族细胞内的蛋白,其中对Smad3研究较多,被认为是最重要的TGF信号转导分子。环孢素A通过下调依赖Smad3蛋白的TGF-β信号,抑制了 smad通路下游靶蛋白如胶原蛋白、细胞因子等的产生,减轻纤维化的进程。白细胞介素(IL)是由巨噬细胞所分泌的多肽类细胞因子,能刺激成纤维细胞的增殖及胶原合成,在肉芽组织及病理性瘢痕组织中均有较强表达。Ghazizadeh等发现瘢痕疙瘩成纤维细胞中的IL-6及其受体IL-6R表达比正常皮肤成纤维细胞平均高6 倍以上,而环孢素A也有很强的抑制白介素生成的作用。这些都为我们认为环孢素A 能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长提供了依据。 ,观察其在体外的生长形态及生长情况。 ,明确其对于瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡的影响。 ,寻找能够有效促使瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的最低环孢素A的浓度范围。 :取自上海市长海医院整形外科及上海市第九人民医院整形外科的7例手术瘢痕疙瘩标本(臀部、肩部各l例、耳垂2例、胸前环孢素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞形态、增殖及凋亡的影响-3- -3- 3例),均无系统性疾病和激素、药物注射史,对用于实验的所取组织患者均知情同意。手术台上取得标本后,用手术刀将瘢痕切成适当大小的组织块。在超净台上,削取lmm厚的瘢痕疙瘩组织片,在培养瓶中培养。待细胞基本爬满瓶底后, %胰蛋白酶消化,按1:2分瓶培养。 :取5个培养皿,其中3个放置玻片,将3-4代成纤维细胞按照1 l0 5/ml注入3ml细胞悬液。2个为空白对照。至细胞长满60%左右时,取出玻片进行HE染色。以1 l0 4/ml细胞接种于 24孔培养板