应用cDNA芯片筛选非浸润性膀胱移行细胞癌差异表达基因.docx

应用cDNA芯片筛选非浸润性膀胱移行细胞癌差异表达基因.docx应用cDNA芯片筛选非浸润性膀胱移行细胞癌差异表达基因摘要:目的研究非肌层浸润性膀胱移行细胞癌()和正常膀胱黏膜上皮差异表达基因。及3例正常膀胱黏膜上皮进行检测,筛选共同表达差异基因。结果共筛选出274个共同差异基因,其中表达上调2倍以上的基因96个,表达下调2倍以上的基因178个。癌变是多基因、多途径、多步骤的复杂过程,高通量的基因芯片技术可以同时定量成千上万基因表达水平,是一种高效、可靠的强大的技术手段。/1/view-:膀胱移行细胞癌;cDNA芯片;基因膀胱癌是我国泌尿外科临床中最常见的恶性肿瘤,其中90%以上为膀胱移行细胞癌(bladdertransitionalcellcarcinoma,),患者初次确诊时为分化良好或中等分化的非肌层浸润性膀胱癌,预后较好,但随肿瘤的分级、分期的升高预后明显变差[1]。及癌旁正常膀胱黏膜上皮组织的基因表达谱,筛选并分析共同差异表达基因,癌变分子机制。~2013年12月手术切除的膀胱移行细胞癌组织标本3例,同期获取膀胱全切患者正常膀胱黏膜作为对照(均经病理证实)。将所获取的新鲜组织样本,立即在液氮中冷冻并储存于-80℃备用。3例膀胱癌患者中,其中男性2例,女性1例,年龄46~71岁,平均57岁,所有患者术前均未做放疗、化疗。病理分级:G12例、G21例。TNM分期:T13例。、纯化和质检按照Trizol试剂(Invitrogen公司,US)提供的标准操作流程提取组织块中的总RNA,通过***仿-异丙醇沉淀法回收,最后用紫外分光光度计检测样本A260/280及总量,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。、清洗染色及扫描检测采用Affymetrix公司HGU219表达谱芯片,芯片可检测约20,000个功能确定、有完整注释基因的36,000个转录本。取上述鉴定合格的总RNA样本,以Oligo(dT)为引物,反转录合成cDNA第一条链,以第一条链为模板合成双链cDNA。用RNA扩增试剂盒进行体外转录并荧光素标记cRNA,再用RNA纯化试剂盒进一步纯化,之后合成片段化cRNA。片段化的cRNA加入120ul杂交液混合后注入杂交条的样品孔内,安装好芯片条,置于45℃杂交仪中,杂交过夜。杂交结束后,将芯片条置于流体工作站进行自动化洗涤和染色步骤。自动清洗染色结束后,再将芯片条放入扫描仪中,关好舱门,进行芯片扫描。,GeneAtlas芯片分析系统的芯片分析功能对芯片杂交图像进行自动分析,获得基因表达的荧光信号强度值(表达丰度值),对数据进行归一化处理。然后采用SAM(SignificantAnalysisofMicroarray)软件倍数差异法,以2倍或以上(Ratio≥2或≤)与正常膀胱黏膜上皮的差异表达基因。,所有组织标本抽提的总RNA的A260/-,RNA样品平均浓度>60ug/ul;RNA电泳条带清晰,28S无明显降解,28S:18SrRNA条带亮度接近或略小于2:1,证实总RNA样品质量合格,符合表达谱芯片实验要求。