荧光定量-PCR-方法：探针法-VS-染料法？.docx

荧光定量PCR方法:探针法VS染料法?荧光定量PCR又称qPCR,是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量PCR荧光为基础对核酸进行定量分析,其应用非常广泛,可以用于检测基因的表达量(RNA的丰度),验证表达谱芯片或转录组测序的数据,确定病原体的载量,V)进行分析,对基因进行分型等等。大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定,其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化,记录检测荧光达到阈值时的循环数(Ct值)。从理论上说,起始模板量和Ct值密切相关,因此我们通过判读Ct值从而对样本进行定量。在进行荧光定量PCR时,从技术和产品来说,我们往往会有许多选择,尤其是方法的选择,对最终结果的准确性至关重要。荧光定量PCR从方法上来说可以分为染料法和探针法两种。 探针法 染料法染料法在国内,染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ,染料法使用简单,成本也相对较低,因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧光定量PCR实验中,染料能够与双链结合,从而发光,而在游离状态下,SYBRGreenI发出微弱的荧光。所以,一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列,且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现,会极大的影响真实结果的准确性。为此,一些厂商提供ROX作为内部荧光参考标准,用来校正背景,但是即便如此,染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段,对于复杂序列,如果难以扩增的话,也会受到脱靶效应(如引物二聚体)的影响。在这种情况下,就需要在实验前期进行熔解曲线分析,判断扩增所得产物是否只有一种。二、TaqMan探针法TaqMan探针法PCR扩增时,在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。Taqman探针为一段线性的寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团(FAM或Hex等)和一个荧光淬灭基团,当探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR仪检测不到荧光信号;当PCR扩增时(在延伸阶段),Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切