C5-siRNA对大鼠心肌缺血损伤的保护作用.pdf

’嬲燃辫博士学位论文 C5一siRNA对大鼠心肌缺血损伤的保护作用博士研究生成玲俐博士生导师李志棵摘要研究背景: 心肌缺血再灌注(myocardial ischemia andreperfusion,M I/R)损伤是指缺血心肌组织在恢复血液灌注后发生的细胞死亡或功能降低。在缺血与再灌注的过程中,尤其是再灌早期,大量补体迅速激活,其激活剂不仅包括抗原抗体复合物、粘多糖、组织蛋白酶、病毒、细菌、特异性哺乳动物细胞、免疫球蛋白聚合体,而且缺血心肌细胞线粒体本身就可释放一些特异性分子经经典途径激活补体系统,补体激活级联反应的终产物一攻膜复合物(C5b一9)乖EI多聚C9沉积在缺血区,与心肌梗死面积有直接关系,是导致细胞死亡的直接因素。因此,针对特异性补体成分C5的治疗,在C5水平抑制补体级联反应以阻止膜攻击复合物的形成和过敏毒素C5a的产生,而仍维持重要补体功能,如调理和免疫复合物清除等, 具有重要意义o RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年发展起来的研究转录后剪切的—种实验方法。它将目的基因所对应的双链RNA导入生物体,导致相应的 mRNA降解,从而使目的基因沉默。我们在本实验中利用RNA干扰技术选择性阻断了补体晚期激活产物C5的表达而抑制补体激活,这样既可达到减轻心肌损伤的目的,又可保留机体必要的免疫功能。目的: 本课题分为四部分,研究采用RNA干扰技术,通过沉默C5补体激活产物的表达而抑制心肌缺血区补体的激活,进而探讨其对心肌缺血再灌注的影响。中文摘要(1)构建小鼠C5基因特异性siRNA慢病毒载体,并对其进行功能性研究。(2) 改进和完善大鼠急性心肌缺血再灌注损伤动物模型的制备及评估。(3)研究 C5一siRNA对大鼠心肌缺血的保护作用。(4)观察C5一siRNA对大鼠心肌缺血的心肌组织病理学的影响。方法: (1)选取C5基因的19nt特异性序列,设计针对C5的siRNA序列,应用基因重组技术插入至IJpGCSIL—GFP慢病毒表达载体中,Age IiEDEcoRI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,重组病毒质粒及其3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofect amine2000共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后在 293_生m胞中测定病毒滴度o (2)健康SD大鼠随机分为3组:假手术组(Sham组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia组),单纯结:j=bLAD30min;缺血再灌注组(IR组),结扎LAD30min, 再灌注120min。每组20只。并从造模成功率、心电图、外周血中LDH、CK—MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方面对改进后的模型进行评估o (3)30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组),对照组(Control组)乖1]C5一siRNA 干预组。结扎对照组和干预组大鼠的冠状动脉前降支近端制备急性大鼠心肌缺血模型,予冠脉前降支支配的中心区分别注射生理盐水和C5一siRNA,1小时后松扎,测定血流动力学参数,心电图改变及血清LDH乖I:ICK-MB变化o (4)30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组),模型组(Ischemia组)乖1:1C5一siRNA 干预组。结扎模型组和干预组大鼠的冠状动脉前降支近端制备急性大鼠心肌缺血模型,予冠脉前降支支配的中心区分别注射生理盐水乖1]C5一siRNA,实验结束后测定心脏指数,光镜观察心肌形态学改变及C5的免疫组织化学染色。结果: (1)通过对pGCSIL—GFP—C5-siRNA载体进行双酶切鉴定,证实短发夹RNA]I=确插入慢病毒载体。DNA)j贝Ii序证实插入的序列正确,C5基因RNA干扰重组慢病毒载体经293细胞包装成功,收集293细胞分泌的病毒上清测定病毒的滴度为5 X 博士学位论文 107U/mL。(2)改进后的造模成功率达到90%以上,血液动力学、心电图、外周血中LDH、 CK—MB的含量测定、心肌病理组织学检查等方式均证实改良后的动物模型成功。(3)C5一siRNA对心肌缺血损伤大鼠血流动力学指标均有一定的改善趋势; C5一siRNA能缩小大鼠结扎冠脉后心电图缺血范围(N—ST)及心肌缺血程度(ST 段位移值),减轻病理学损伤;对严重的心肌缺血引起的血清LDH和CK—MB 升高也有明显降低作用,尤其是其中CK—MB与模型组相比差异显著(1109± 245U/L VS1513±335 U/L)(p<)o (4)C5一siRNA对心肌缺血损伤大鼠的心脏指数没影响,C5一siRNA能减轻心肌缺血的病理学损伤。免疫组织化学结果显示,模型组与干预组的C5表达量均明显高于假手术组(P<),而干预组的C5表达量虽与模型对照组相比有所降低,但二者没有统计学意义的差别(P=0.