leukamenine对原代培养大鼠脑星形神经胶质细胞毒性作用研究.pdf

西北师范大学
硕士学位论文
LeukameninE对原代培养大鼠脑星形神经胶质细胞毒性作用的研
究
姓名:张丽
申请学位级别:硕士
专业:细胞生物学
指导教师:刘国安
2009-06
西北师范大学硕士学位论文张丽
摘要
毒理学是研究化学物质对生物体的毒性反应及其严重程度、发生频率和毒性作用机
制,也是对毒性作用进行定性和定量评价的一门学科。体外细胞实验等生物技术由于其
高通量、高精度、快速以及平行性的特点,已成为生物医学研究领域中的一项先进实用
的技术,具有很高的应用价值。毒理学的研究必定要深入到细胞及分子水平。中药(尤
其是其复方制剂)成分复杂,应用传统方法评价中药的遗传毒性十分困难,而借助现代
细胞学技术,从细胞水平上对药物在体外进行准确、快速、高效的安全性评价,使得我
们能从微观角度更好地了解中药遗传毒性的作用靶点及其作用机制。
星形神经胶质细胞(astrocyte,AS),作为神经系统中起营养、支持及保护神经元
作用的一类细胞,由于其敏感性高,更易受到毒性物质的损伤。许多证据表明,星形神
经胶质细胞在许多神经退行性疾病中有十分重要的作用。迄今为止,有关星形神经胶质
细胞毒性的研究尚未见到报道。
香茶菜属植物几乎遍布我国各地,并且种类繁多,约有 30 种原植物在民间作药用,
具有清热解毒、活血化淤、抗菌消炎、抗肿瘤、治疗肝炎等各种功效。在药用香茶菜中,
二萜类化合物含量丰富,是其主要的活性成分。其中 C-20-未氧化-对映-贝壳杉烯型二萜
化合物是生物活性最强的一类,Leukamenin E 即为其中的一种。
本论文进行了 Wistar 大鼠星形神经胶质细胞的纯化培养,以对映-贝壳杉烯二萜化
合物 Leukamenin E 为受试药物,通过 SRB 检测、台盼蓝排染、彗星电泳、吖啶橙/溴化
乙锭(AO/EB)双染、细胞形态的观察及核染色质形态观察等方法,初步研究了该化合
物对星形神经胶质细胞生长的影响以及其作用机制,以期为 Leukamenin E 的进一步合
理应用提供科学依据。结果如下:
(1)成功培养了 AS 并对其进行了纯化。实验通过组织消化、限制性培养以及摇床震
荡等方法,得到了纯度高、状态良好的 AS 培养物。原代培养的 AS 在接种后 2-3d 完成
贴壁,9-12d 即可铺满培养瓶底。初级培养物含有包括小胶质细胞、成纤维细胞、少量
神经元在内的多种细胞,通过限制性培养降低这些细胞的含量,而神经元逐渐退化,最
终死亡;摇床震荡利用细胞差速贴壁的原理,除去杂细胞,最终得到纯度较高的 AS 培
养物。
(2)SRB法及台盼蓝排染法检测细胞毒性结果显示,Leukamenin E对AS有很强的细胞
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毒性,,而在5μM
以及10μM的高浓度作用时能致细胞死亡。生长抑制效应和致死效应都具有显著的时间、
剂量依赖性。
(3) 倒置显微镜形态观察及吉姆萨染色显示,Leukamenin E作用可以引起细胞形态
的显著改变,并且有明显的时间、剂量效应。吉姆萨染色实验中,随化合物浓度的增加
(、),细胞膜表面微绒毛不清晰甚至消失,细胞核染色质凝集,在高浓
度药物(5μM)作用下,观察到核碎裂。
(4)彗星电泳实验结果显示,化合物Leukamenin E可以引起AS DNA的损伤,并具有
时间-剂量效应。随着化合物作用浓度的增加以及作用时间的延长,损伤细胞——彗星
样细胞增多、损伤率显著增加,Olive尾矩(OTM)、尾长(TL)、尾部DNA的量(TDNA)
也明显增加,并且细胞的损伤等级也随之升高。
(5) Hoechst 33258荧光染色以及AO/EB双染实验结果显示,Leukamenin E作用使细
胞表现出明显的凋亡性特征,这说明Leukamenin E主要通过凋亡的方式引起星形神经胶
质细胞的死亡,并且具有显著的时间-剂量效应。
关键词:Leukamenin E;星形神经胶质细胞;细胞毒性;生长抑制;DNA 损伤;细胞凋
亡










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Abstract
Toxicology is a area to study the toxic reaction, degree of damage, frequency and the
mechanism of toxicity of chemical materials, anism, and to e