双抗体夹心法.docx

双抗体夹心法 双抗体夹心法 ,属于非竞争结合测定 .它是检测抗原最常用的 ELISA, 适用于检测分子 中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原 ,而不能用于小分子半抗原的检测 . 其基本工作原理是 :利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测 抗原分子上两个抗原决定簇结合 ,形成固相抗体 -抗原 -酶标抗体免疫复合物 .由于反 应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的 ,因此复合物的形成量
与待测抗原的含量成正比 （在方法可检测范围内 ）. 测定复合物中的酶作用于加入的底 物后生成的有色物质量 （OD 值 ）,即可确定待测抗原含量 . 若固相载体上的抗体和酶 标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合 ,则属于双位点 夹心法 .若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合 ,则
是双抗原夹心法 .
操作步骤 :
⑴将特异性抗体包被固相载体 McAb. 孵育一定时间 ,使形成固相抗体 ,洗涤除去未结 合的抗体和杂质 .
⑵加待检标本 ,孵育 ,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应 ,形成固相抗原抗
体复合物 .洗涤除去其他未结合物质 .
⑶加酶标抗体 ,孵育,使形成固相抗体 -待测抗原 -酶标抗体夹心复合物 .洗涤除去未结 合酶标抗体 .
⑷加底物显色 .固相上的酶催化底物产生有色产物 ,通过比色 ,测标本中抗原的量 . 现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体 ,则受检样
品和酶标抗体可一次性加入 ,简化流程 ,缩短反应时间 .若标本中待测抗原浓度过高 ,抗 原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物 （类似于免疫沉淀反
应中抗原过剩时的后带现象 ）,使最终结果低于实际含量 （钩状效应 ）,甚至出现假阴性 .另外，当血清中存在类风湿因子（RF）时，类
风湿因子（RF）可充当抗原 而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物，从而出 现假阳性结果 .
间接法 此法是测定抗体最常用的方法 ,属非竞争结合试验 .其原理是将抗原连接到固相载体 上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原 -受检抗体复合物 ,再用酶标二抗 （针对受检
抗体的抗体 ,如羊抗人 IgG 抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合 ,形成固相抗原 -受检 抗体-酶标二抗复合物 ,测定加底物后的显色程度 ,确定待测抗体含量 .
操作步骤
⑴将已知抗原包被固相载体 ,形成固相抗原 .洗涤除去未结合的抗原及杂质 . ⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭，阻止待检血清中非特异IgG吸附固相.
⑶加待检血清 ,孵育 ,使固相抗原和待检抗体充分结合 ,洗涤除去未结合的非特异抗体 及其他血清成分 .
⑷加酶标抗体或酶标 SPA,孵育,形成固相抗原彳寺检抗体-酶标抗抗体（或酶标SPA复 合物.
⑸加底物显色 .
间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子 （如抗人IgG）,因此该法只需 要换固相抗原 ,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体 ,具有更广泛的通用 性.
竞争法
竞争法 ELISA 可用于抗原和半抗原的定量测定 ,也可对抗体进行检测 .其方法和特点 是:①酶标记抗原 （抗体 ）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与