重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中表达、纯化和性质研究.pdf

重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的表达、纯化和性质研究导师姓名:袁建刚教授强伯勤学科专业:研究方向:中国医学科学院基础医学研究所研究生姓名:文中伟彭小忠副教授生物化学与分子生物学基因分子生物学入学时间:年所在院所:中国协和医科大学基础医学院二五年六月论文题目中国协和医科大学硕士研究生学位论文
摘要原性;最大吸收峰为坏鹊绲阄.;氨基酸组成分析与理论值基本一致;±垦堡塑垦型查堂堡主堂堡鲨壅经元和非神经元细胞的存活。后来发现,通过与海马区的受体复合物的结达。本研究利用桥式际蹩寺×巳薱失了┒霭被岬耐槐涮録重组质粒,表达的重组蛋白命名为纯化,获得高纯度的蛋白。最后对获得的进行理化性质的研究,包括:分子量测定、纯度分析、免疫原性测定、紫外吸收分析、等电点分析、氨基酸组分分析、结果表明,用温度诱导型载体表达的效果较好。筛选到的工程菌在℃培养至菌密度为如..保糜嫦掠盏瑀泶锪孔罡撸锞体总蛋白量的%以上,获得了高效表达。经和尿素漂洗包涵体、稀释法和透析法复性、一步畇阄龃炕炔街瑁玫酱慷雀叽ヒ陨系。最终每升菌液可获得高纯度的鞍自砘副甑募本研究建立了一种简单、廉价、高效的获得姆椒āU饨猺慕睫状神经营养因子鐁怯晌挥谥芪窬椭惺嗌经系统的胶质细胞表达的一种神经细胞因子。最初认为的功能是维持和促进神合,活化抑制食欲的信号通路而具有潜在的减肥作用。近年来,的生理功能及相关机制已成为一个热点研究课题。因此的研究具有重要的科学价值和临床应用前景。获得足够量的纯化产物是进行理论或应用研究的前提条件。为此本研究希望建立一套在大肠杆菌表达系统中表达及其纯化的方案,以获得的高效表基因,并构建了缺礹Mü泶镌靥宓难≡瘛⒐こ叹的筛选、表达条件的优化等过程,以实现的高效表达。随后经包涵体复性及肽图分析、瞬庑虻取定结果显示:分子量为.:纯度约达%;具有类似天然的抗肽图分析与理论匹配;┒霭被嵊肜砺踨·位的氨基酸序列一致。一步功能研究及开发应用打下赵好基础。
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日青在后来进行治疗肌萎缩侧索硬化症鷜睫状神经营养因子得了的】。睫状神经营养因子自年代发现以来倍受重视,其对神经细胞的生长、分化具有明显的营养作用—俊K孀叛芯坎欢仙钊耄阎鸩饺识到在神经性系统的退行性病变,如肌萎缩侧索硬化、帕金森氏症、阿耳茨海默氏病、亨廷顿氏病的医用价值,并已开始应用于临床【俊瘟品逝值淖饔檬床研究中偶然发现的【俊蟳珿T谙赴ど蟜】。饕7植的亲和力与可溶性的岷稀T僬心剂硗饬礁鍪芴逖腔和倚—、厶—,【俊闔等最早发现,年等从鸡睫状神经元提取获得【浚年琇然的临是由中枢神经系统和外周神经系统的神经胶质细胞表达的多功能神经营养因子,人睫状神经生长因子,由霭被嶙槌桑肿恿约。受体姆肿恿吭嘉怯扇鲅腔猘、.蚲钩傻母春咸澹琧畁属非跨膜蛋白质,其借糖基~磷脂酰肌醇键于神经组织,其他组织如骨骼肌、脂肪组织、脾脏、心脏、胃、肺脏、肾上腺、皮肤、肾脏、睾丸等也有分布,不同组织Ⅱ的表达水平不同【】。和印存在于细胞膜上,参与与疶的偶联,起信号传递作用【】。先以较低成较牢固的复合体,复合体中各分子比例为:,随后激活胞内的痵号通路引起各种生物学效应【】。大量文献报道了的减肥机制。目前研究认为可能通过多种途径发挥减肥的作用。在中枢,通过调控海马区弓状核和室旁核的神经元来调节食欲和能量平衡。弓状核有两类浦肯野细胞分别分泌食欲刺激信号分子鏝,和褪秤种菩藕欧肿如虲【】。可以抑制谋泶铮灰种芅对室旁核窬5囊种菩вΓ跞鹾B砬鳱譱中国协和医科大学硕貉宦畚鴈
锏嫠芸研筒槔急ぶ骼夹┍ぼ可以改善脂肪组织胰岛素受体的敏感性,调节脂肪细胞的代谢【】:改善肝功能,防减肥作用早就引起了国外制药公司的注意。但到目前为止全球范围内还没有作为减肥药物上市。咀钤缈7⒘薱浞⒚鞯腸有糖基化的修饰才有活性,有些蛋白甚至含有较多的二硫键,因此该系统的应用范围适于在大肠杆菌中表达。因此本研究希望建立一套在大肠杆菌表达系统中表达的信号通路;可以抑制室旁核神经元的,从而抑制慕食信号俊的减少不仅可以抑制食欲,而且可以促进交感神经对灰色脂肪组织的刺激,上调的表达,增加产热,从而增加能量代谢【】。在外周,通过对脂肪组织、肝脏的能量代谢的调节起到综合的减肥作用。止脂肪肝的形成,增强肝胰岛素的敏感性,从而改善二型糖尿病的异常指标绺胰岛素血症、高血糖、高血脂浚换箍梢钥刂浦咀橹娜萘浚帜芰康拇谢平衡【】。生体唐访狝讶爰醴嗜诹俅彩笛椤。国内对的开发尚处于上游工艺的研究。基因工程蛋白的高效