PCR及反应条件的优化因素.ppt

1. 目的 DN***段
质粒
TA载体
5.
重组质粒
目的 DNA
6. 转化
死亡
存活
含抗生素培养基中生长
2. PCR
2-3min
实验课安排
质粒提取

PCR及反应条件的优化因素
实验报告要求
最后2学时进行实验课考试(20分)
开卷, 但不许抄袭其它同学试卷。
内容为两个实验：
实验目的、主要步骤（简答）、－－－（3分）
结果（画图）、结果分析、 －－－（4分）
有关实验的问答题（注意听讲）－－－（3分）
4. 收卷时签名。
PCR及反应条件的优化因素
实验一、 基因组DNA的提取、电泳
第一部分：肝组织制备及蛋白酶K消化
第二部分：酚***仿抽提及乙醇沉淀
第三部分：DNA琼脂糖凝胶电泳
预期结果
1 2 3 4 5
Marker
总DNA
PCR及反应条件的优化因素
如果是Smear带，说明所提基因组DNA的断裂现象严重。
思考题：
1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么?
***仿, 乙醇, EDTA
2. DNA提取过程中应注意什么？
PCR及反应条件的优化因素
凝胶成像系统：
PCR及反应条件的优化因素
实验二、 PCR扩增特定基因片断
实验背景
基本原理
PCR操作
引物设计
注意事项
PCR的应用
PCR及反应条件的优化因素
一．实验背景
The polymerase chain reaction (PCR) is invented by K. Mullis in 1985.
This technique is used to amplify a sequence of DNA in vitro by simulating the replication procedure of natural DNA in vivo.
PCR enable us to unlimitedly amplify DNA fragments.
The Nobel Prize in Chemistry 1993
PCR及反应条件的优化因素
二．PCR基本原理
3’
5’
3’
5’
PCR
3’
5’
5’
3’
5’
5’
target sequence
在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
PCR及反应条件的优化因素
pre-denaturation 95℃ for 5min;
Denaturation: 95℃ for 30~60s
Annealing: 37~68℃ for 30~60s
extension: 72℃ for 30s~2min
72℃ extension for 10 min
30 cycles
反应分三步： ① 变性（denaturation）；
② 退火（annealing）；
③ 延伸（extension）
PCR及反应条件的优化因素