枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE定向进化研究.pdf

华中农业大学
硕士学位论文
枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE的定向进化研究
姓名:侯化鹏
申请学位级别:硕士
专业:基础兽医学
指导教师:龙良启;伍晓雄
20080601
摘要恰ɡ啾还惴河τ糜诠ひ瞪要是通过体外定向分子进化技术,改造基因,从而构建能够高效稳定生产中擞肞技术,从枯草芽孢杆菌标准株扩增出强启动子蛄泻蚽长基因。克隆到甌载体中,鉴定了上述基因。标准株序列与已公布序全长基因。辏⒃诳莶菅挎吒司斜泶铮。电泳分析,重组菌可表达分子量分别约为牡鞍住>股匮沽ρ≡窈螅泶锪吭贠为时,酶詎ǔせ蛭3龇⒌悖τ没蚣易甯淖分析表明,基因的碱基发生了改变。这种改变引起了其产物中性蛋白酶分子的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶酶类,在洗涤剂、制革、丝绸、食品加工等多种行业上有着广泛的用途。本课题主性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株。主要结果如下:列完全相同。瞬鞍酌感式细叩攴掷胫辏琍扩增得到其中甑膎菇ǹ莶菅挎吒司吮泶镌靥錺.,重组质粒转化枯草芽孢杆菌产量出现最高,粗酶液酶活力达到了出发菌株的丁技术,以标准株和野生型菌株的基因作为材料,对其进行突变。在酶产率未提高的情况下,第一轮筛选,突变株酶活力提高了ィ缘谝宦稚秆〉母呋盍ν变株为基础进行第二轮突变和筛选,酶活力又提高了将近%,且能够稳定遗传。氨基酸的改变,从而造成酶活力的改变。通过比较,发现应用表达载体在抗生素压力下提高了酶的产量。定向进化则改变了基因结构从而提高了酶活力,相比表达载体更为经济和稳定。关键词:枯草芽孢杆菌;中性蛋白酶;基因克隆和表达;淖椋煌粗刈枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向进化研究
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研究生签名:彳吴九蠊炝荚学位论文作者签名:钓移略签名日期:涂竽晗缭旅时间:办归留年钐月乡日签名日期:阳增年占月岁日华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书如需保密,解密时间年独创性声明学位论文使用授权书月日本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,指导教师对此进行了审定。与我一同鞯耐径员狙芯克龅娜何贡献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意。本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定,即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版和电子版,并提供目录检索和阅览服务,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容,并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并进行信息服务ǖú幌抻诨惚唷复制、发行、信息网络传播等北救吮A粼谄渌教宸⒈砺畚牡娜Α注:保密学位论文瓷婕凹际趺孛堋⑸桃得孛芑蛏昵胱ɡ惹痹谛枰L峤槐C艿穆文诮饷芎笫视糜诒臼谌ㄊ椤导师签名学位论文是否保密注:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间,
,于年被首次提出,至今己有辍J歉锢际涎芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌;地衣芽孢杆菌欢绦⊙挎吒司;纳豆芽孢杆菌等不同的种。科学研究中应用最多的是枯草芽孢杆菌,例如菌株捌浯罅康难苌辍⑾挚莶菅挎吒菌晡?勺;暌岳矗莶菅挎吒司囊糯а芯抗ぷ鞑欢仙钊牒头⒄埂美国俄亥俄州立大学芽孢杆菌遗传保存中一瓯4娴菌株的遗传突变菌株就有??勺;辏又幸卜掷氤鲂矶嗤槐涮澹ǜ咦;德枯草芽孢杆菌只有隐秘性质粒的困难,枯草芽孢杆菌基因工程的研究更加迅速。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,细胞壁不含内毒素,能形成芽孢,是一些重要猓匀诵笪薅尽?莶莞司还惴河糜诖车氖澄铮戏⒔停枯草芽孢杆菌表达系统作为新兴的表达系统,具有安全性高、生长迅速、培养条件简单、遗传背景清晰等优点。且有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统,从芽孢杆菌表达系统的载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种。琾等。在这些质粒的基础上构建了双标记质粒、芽孢杆菌一大肠杆菌穿枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向进化研究性细菌的典型代表蛭婪娴龋。;苏云金芽孢杆菌;嗜碱芽孢杆菌坏矸垩挎吒司,.聊括痪薮笱挎吒司;以及病原