医学检测-产前_new_new讲解.docx

以下是简单整理的东西产前实验流程解析. 提取. 文库构建主要内容: 血浆分离实验流程: 1. 预冷离心机。 2. 将全血按同的医院代码分类, 记录各医院全血的流水号, 然后置于 4℃冰箱暂存。 3. 待离心机预冷至 4℃, 将全血样品置于离心机中( 离心时注意严格配平), 1600g 离心 10min 。此过程可准备实验需要的中转管和最终管。 4. 离心完成后吸取上清液平均分到 2 个或多个已编号的 管中, 注意核对样本编号及能吸到白细胞和红细胞, 此过程需要在冰盒上操作,并严格对号。 5. 将上一步得到的血浆置于预先冷却至 4℃的离心机, 16000g 离心 10min , 离心后将上清转入新的已编号及贴好血浆条码 mLE P 管中, 至少保证前 3 管体积为 600ul , 此过程同样需要在冰盒上操作, 并严格对号。 6. 分离完成后制作产前血浆分离反馈表. 注意事项 1. 全血样本必需在离体 8 小时内分离完血浆。 2. 必需保证样本在低温条件下离心,离心时应严格配平。 3. 开启 EP 管盖时,注意能碰到 EP 管内盖。 4. 血浆分离结束后, 若短期内无法将样本送往配送组入库, 必需将样本置于-20 ℃冰箱中暂存。 5. 离心机使用结束后应及时关掉电源。 6. 吸取上清时慢吸慢打, 吸到中间层的白细胞, 若吸到白细胞应将全血重新离心。 DNA 清洗液为酸性溶液, 能用于清洗离心机转子, 以免腐蚀转子。 8. 实验所用 EP 管架需定期用 1% 盐酸浸泡过夜后洗净再使用。 9. 若实验室未配制 DNA 清洗液,可用 10% 次氯酸钠代替,使用方法同 DNA 清洗液。问题问:第一步离心后,从采血管内吸取血浆时,吸到白细胞和红细胞,怎么处理? 答:重新离心 5-10min 问: 为什么要严格要求第一步分离血浆时能吸到中间层的白细胞和红细胞? 答: 由于第二步高速离心会使得有核细胞破裂, 造成人体基因组 DNA 的释放,母体 DNA 背景过大,从而影响实验结果。问:为什么无创产前基因检测样品类型是血浆而选用血清? 答: 血清是添加抗凝剂而通过自体纤维蛋白原和凝血因子分离出来的上清液, 血浆则是添加抗凝剂后析出的上清液。血清在血凝块收缩时会导致细胞内 DNA 的释放,导致母体背景 DNA 过大,影响实验结果, 而血浆内基质更稳定,可保存时间更长。 DNA 提取原理: 在高盐低 pH 的条件下通过硅胶膜特异吸附,将裂解液中的 DNA 吸附到硅胶膜上,去除杂质后用低盐洗脱液洗脱得到吸附在膜上的 DNA 。天根试剂盒 DNA 提取简易流程 600 μL 血浆+10 μL 蛋白酶 K 加入 600 μ LGBmix ( GB: carrier RNA=1mL : 10μL) ,混匀 56℃水浴 10 min ,取出后冷却 5min ,短暂离心加入 300 μL 冷冻无水乙醇,轻轻颠倒混匀将混合液转入提取柱中, 8000rpm 离心 30s 弃滤液,加入 500 μ LGD , 8000 rpm 离心 30s 弃滤液,加入 500 μ LPW , 8000 rpm 离心 30s (重复 1 次) 弃滤液, 12000 rpm 离心 2min 将提取柱放在 mL 离心管上晾干 3 min 加入 90μL( 其中 5μL 为损耗) TB 溶解 5 min , 12000 rpm 离心 2 min QIAGEN 试剂盒 DNA 提取简易流程 600 μL 血浆+10 μL 蛋白酶 K 加入 600 μ LALmix ( AL: carrier RNA=1mL : 10μL) ,混匀 56℃水浴 10 min ,取出后冷却 5min ,短暂离心加入 300 μL 冷冻无水乙醇,轻轻颠倒混匀将混合液转入提取柱中, 8000rpm 离心 30s 弃滤液,加入 700 μ LAW1 , 8000 rpm 离心 30s 弃滤液,加入 500 μ LAW2 , 8000 rpm 离心 30s 弃滤液, 12000 rpm 离心 2min 将提取柱放在 mL 离心管上晾干 3 min 加入 90μL( 其中 5μL 为损耗) AE 溶解 5 min , 12000 rpm 离心 2 min 提取试剂的作用蛋白酶 K :裂解蛋白,核酸释放 GB 缓冲液:裂解细胞、提供稳定的高盐环境 Carrier RNA :提高 DNA 不吸附柱上硅胶膜的结合,从而提高 DNA 的产率无水乙醇:沉淀 DNA GD :去除蛋白等杂质 PW :去除盐离子等杂质 TB: 溶解回收 DNA 实验细节 配制加入 carrierRNA 之后,必须在瓶壁上标志并写上配制日期。 、 PW 配制时,加