真菌DNA序列分析参考文献.doc

绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究
谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君
摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养图谱中能找到对应的位置。通过土豆培养基、察氏培养基和麦曲浸提液培养基对麦曲中的真菌进行分离，共得到24株真菌。三种培养基分离得到的纯种数目和菌落数分别为8种、18种、×104 cfu/g曲、×104 cfu/g曲、×104 cfu/g曲。不同的培养基分离出来的优势菌不一样，每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株。必须联合使用多种培养基才能最大限度和更加准确的分离和了解麦曲中的真菌及其群落结构。
关键词：绍兴黄酒；麦曲；微生物群落结构；DNA提取；核糖体基因间隔区分析 (RISA)
前言
麦曲在黄酒的酿造过程中起着非常重要的作用。它是在一定的地理环境和生长条件下，通过制曲工艺的驯化，其中的微生物不断的发生着有序的消长和变化，逐步形成稳定的微生物区系。分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理解制曲过程中的微生物和周边环境的相互关系，建立麦曲微生物生态数据库，实现麦曲微生态系统的人工模拟和异域再现具有重要的指导意义。国内对黄酒麦曲中的微生物尤其是真菌从筛选产酶的角度进行过研究，通过传统的分离培养方法[1]对真菌的种类进行分类鉴定，操作方法繁琐、周期较长，而且对鉴定者经验要求较高。而对于麦曲中的微生物群落结构以及微生物种群之间的相互影响的关系，即微生物生态还未见研究报告。目前，微生物生态学的研究有两个主要趋势：一方面，结合传统研究方法和各种分子生物学技术对不同环境的微生物群落进行研究，使人们能更加客观地认识环境中微生物的自然存在状况；另一方面，加强对各种复杂环境微生物的研究，希望从中发现更多新的微生物及基因资源，了解微生物对特定环境的适应机制，为合理利用和保护微生物资源奠定基础。因此，本章采用不同的培养基对黄酒麦曲中可培养真菌进行系统分离和初步研究，同时比较不同培养基的分离能力。通过大规模的平板稀释分离，将得到的不同种的真菌采用扩增真菌的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS）保守序列，测定其序列组成，然后通过序列比对的方式对未知真菌进行鉴定。另外，采用免培养的方法对麦曲中的真菌进行分离鉴定，通过比较，以综合利用这两种方法，更加客观准确地了解和掌握麦曲中真菌的群落结构。
1. 材料与方法
麦曲样品的收集与保存
黄酒麦曲样品采自绍兴黄酒厂某分厂的成品麦曲JH。样品采集完成后转入无菌塑料袋中带回实验室。分别取两块平行样品，粉碎，混合均匀，得到均一样品后，称取500 g放入塑料袋中，保存于4 ℃备用。
分离培养基
土豆琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、定容至1000 mL、pH自然。
察氏培养基（CPK）：NaNO3, 2 g、 K2HPO4, 1 g、KCl, g、MgSO4·7H2O, g、FeSO4·7H2O, g、蔗糖30 g、定容至1000 mL。
麦曲浸提液培养基(WQE): 500 g 粉碎的麦曲样品，加入1500 mL蒸馏水，100 ℃煮沸1 h 后，用四层纱布过滤，
MPa下灭菌20 min备用[2]。
三种培养基中均添加去氧胆酸100 mg/L、链霉素3 × 104 U/L分别抑制菌丝的蔓延和细菌的生长，各培养基的固态培养基琼脂的添加量均为15 g/L， MPa下灭菌20 min。

取10 g均一麦曲样品，加入到90 mL磷酸盐缓冲液中(PBS, 137 mmol/LNaCl, mmol/L KCl, mmol/L NaH2PO4·7H2O, mmol/L KH2PO4, pH )，轻轻振荡10 min。取上清液分别用PBS作梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。
平板稀释分离：取不同稀释度的样品100 μL，分别涂布于对应的固态培养基上，每个稀释度作五个平行。其间进行平板菌落计数，表示单位为cfu/g干曲。然后根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，分离纯化，得到纯种菌株。
液态培养基富集：取不同稀释度的样品1 mL 分别接入(接种量为10%, v/v)到装有9 mL各种培养基(PDA, CPK 和 WQE)的试管中，在30℃下振荡培养2天。


采用***化苄抽提真菌DNA[3]：用接种环刮取一环纯种斜面的