重组新生血管生成抑制因子rhK4K5研制及其功能研究.pdf

复旦大学
博士学位论文
重组新生血管生成抑制因子rh-K4K5的研制及其功能研究
姓名:官孝群
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:宋后燕

的多拷贝转化子。米;游<状祭没郝重组新生血管生成抑制因子—的研制及其功能研究摘要人猘￡墙攴⑾值男律9苌梢种埔蜃又唬够特异抑制血管内皮细胞的增生和迁移【铮嗄芤种贫嘀种琢龅纳び胱R啤人侨讼巳苊冈琱荒┒私到馄危嗟荒┒个—,其抑制活性存在于—在荒┒斯灿个丝氨酸蛋白酶的典型峁褂一恳笤加霭被嶙槌桑缓对二硫键,稳定峁梗焊鱇区氨基酸同源性在%左右。除外,其它寄芴匾煲种芺榈嫉呐C秆9苣皮珺赴脑鲋常渲蠯种谱饔米钋俊为了进一步分析纳镅Щ钚裕颐抢猛茨=ǖ姆椒ǎ岷匣蚬程技术,研制了重组狵并研究—对新生血管生成的抑制作鉴于阅谄は赴鲋场⑿律9苌捎幸种谱饔茫颐峭ü扑机模拟,设计了分子,并应用椒ǎ┰隽巳讼巳苊冈璌基因,与分泌型酵母表达质粒重组后,转化甲醇营养型酵母得了高效表达,碖基因取代拇氧化酶基因W;釉趐..北泶锼礁撸镂榷ā分泌表达—。因培液中的内毒素物质干扰訠细胞增殖的抑制作用。所以,表达产物必需经纯化后才可用于活性测定;而进一步评价—的抑制活性,。为此,—的纯化技术。我们利用发酵罐发酵。工程菌对数生长小时,菌液密度左右,诱导培养小时,菌液密度纱。表达产物—超过7⒔蜕锨逋蜒魏螅汗恕⒗胱咏换欢酱炕可⒔鸵嚎苫得—纯品约纯度ィ琇甅舛╮狵肿恿为狵科纺芟灾种艬细胞增殖,其半效抑制浓度约为上述实验结果表明:我们初步建立了—工程菌高密度发酵方法及—的纯化路线,获得了活性表达产物。于用。,获/
八上述结果提示—有治疗与新生血管生成有关疾病的临床前景。我们用鸡胚绒毛尿囊膜研究—纯品的抗新生血管生成活性。每一鸡胚给予—纯品,肉眼下可观察到—对鸡胚新生血管生成的抑制作用,血管密度随—剂量增加而递减。在光学显微镜下观察,我们发现,对照组即檠9苌ち己茫9芊种手校徊煌亮看碜橹本缎难9苁灾来渭跎伲9苁直鹞#篜组.、组.、组.,组瑀碜、、男⊙9苁攵哉兆嫌型臣蒲б庖,表明狵种萍ε逤新生血管生成。同样,我们研究了—纯品对实验性兔角膜新生血管生成、实验性小鼠视网膜新生血管生成的抑制作用,初步显示量效关系。由于—纯品抑制新生血管生成,而肿瘤生长需要新生血管生成,我们又利用种植了人肺腺癌的裸小鼠肿瘤模型研究了—纯品的抑瘤活性。每隔一天瘤旁注射“曲一纯品,天后处死。结果显示,—高剂量治疗组,肿瘤组织明显比其它两组小,平均瘤重为簍:⒌图亮孔为:恕8呒亮孔橛攵哉兆楸冉嫌型计学意义。—能抑制实验性人肺腺癌瓵ぃ图亮孔橹琢鲆种坡为%,,—;基因克隆表达炕突钚匝芯中图分类号:于畉
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新生血管生成珹是仓『擞稀⑴咛シ⒂⑵鞴傩纬伞⒆橹生与再造等过程必不可少的组成部分,它是包括内皮细胞增殖、迁移、分化、胞外基质降解、以及新毛细血管生成等多个环节的复杂过程,受到多重调控。在病理条件下,上行调节促新生血管生成因子或下行调节新生血管生成抑制因子的表达,能够启动新生血管生成,导致许多疾病如肿瘤生长、糖尿病视网膜病变等的发生与发展许多研究结果表明肿瘤的生长和转移依赖新生血管生成【。R种苹蚱苹敌律9苌桑蚰茏柚挂览敌律9苌傻牟”洌律血管生成抑制因子珹虼顺晌Q芯咳鹊鉏啊俊早在年,┦看又琢鲎橹蟹掷氤觥爸琢鲆蜃印保俳律管生成‘薄K岢觥爸琢錾び胱R埔览敌律9苌桑种菩律9苌煽梢治疗癌症”的假说薄俊4恿俅埠褪笛橹泄鄄斓剑笾琢龃嬖谑蹦芄灰种菩≈琢龅生长,一旦原发肿瘤切除,转移灶迅速生长;如果原发肿瘤部分切除,残余肿瘤生长加快。随着一些刺激血管生成与阻遏分子,尤其是一些与肿瘤发生密切相关的生长因子鏥、蚑等姆⑾郑岣涣烁眉偎档哪诤D前认为原发肿瘤能够产生新生血管生成刺激因子和新生血管生成刺激因子抑制因子,谠⒃睿超过,刺激自身新生血管生成和肿瘤生长;由原发灶产生经血循环到达转移灶或继发性肿瘤灶,超过从原发灶逸出或继发灶产生的,抑制该处新生血管生成和肿瘤生长;新生血管生成过程启动与否取决于血管生成刺激因子和血管生成抑制因子的局部平衡。基于这一假设和研究,已经发现了一系列内源性新生血管生成抑制因子,它们是大分子蛋白质的降解片段或隐蔽的结构域。血栓粘合素琓问墙显绶⑾值模芤种评丛从诩兔黄体⑴I錾舷倨ぶ屎头味龅哪谄は赴鲋场一旧聿没有引起足够的重视,但却激发了研究者们探索内源性蛋白抑制因子的兴趣,导致琫等的发现。