wb标准protocol.pdf

成功完成 Western Blot 检测，必须满足 4 个条件：
1 凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法
在膜上进行分析
2 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行
分析
3 处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
4 处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法
检测
成功进行 WB 检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，
即可快速和准确的找到 WB 的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设
置的对照如下：
 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
 内参对照：检测标本的质量和二抗系统
 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

WB 检测基本过程
1、获取细胞或组织裂解物
1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解 buffer：
蛋白位置 推荐 buffer
全细胞 NP-40 or RIPA
胞浆（可溶性蛋白） Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白） Tris-Triton
膜蛋白 NP-40 or RIPA
核蛋白 RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白 RIPA or 线粒体分离试剂盒
亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量
2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
电话：********** QQ：1046485526 邮箱：******@ 网站：
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或 BCA assay。定量后，可根据情
况将标本保存在-20°C /-80°C 备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态 凝胶条件 上样 buffer 电泳 buffer
Reduced - Denatured 还原，变性 含 β-巯基乙醇或