生化大实验实验报告.doc

一蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶( PPO )的分离提取一、材料与试剂(1 )马铃薯(大约每小组 200-300g ) (2 )试剂: 磷酸缓冲液 ( 内含 巯基乙醇, EDTA , 5% 甘油, 1% 的聚乙烯吡咯烷***) 配制时配×10 倍的浓缩液 1000ml ; 固体硫酸铵; M 磷酸缓冲液 (内含 m 巯基乙醇, EDTA , MgCL 2 )配置时配。(3 )实验器械与仪器设备: 试管与试管架; 烧杯、玻璃搅棒; 移液管、滴管等; 试剂瓶; 透析袋; 过滤纱布; 植物组织匀浆器; PH 计和 PH 试纸; GL-20C 高速冷冻离心机; DL-7A 大容量低速冷冻离心机二、操作步骤 1 :粗酶提取: 马铃薯组织按 1:1( W/V ) 比例与 磷酸缓冲液 ( 内含 巯基乙醇, EDTA , 5% 甘油, 1% 聚乙烯吡咯烷***) 混合, 匀浆 4 层后纱布过滤, 滤液以 6000rpm 离心 10min , 弃除沉淀获得酶提取液。 2 :盐析分级沉淀: 在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到 40% 饱和度(边加边搅拌达到充分溶解) ,然后 6000rpm 离心 20min 弃除沉淀;离心上清液在加入固体硫酸铵达到 70% 饱和度(边加边搅拌达到充分溶解) ,再以 6000rpm 离心 20min ,弃除上清夜,收集粗酶沉淀。沉淀用 磷酸缓冲液 (内含 巯基乙醇, EDTA , MgCL 2 )溶解,装入透析袋中用 KCL 溶液透析至无硫酸铵根离子,获得粗酶液供上柱使用。三、实验结果获得 PPO 粗酶液供上柱使用。实验二柱层析纯化 PPO 一、材料与试剂试剂: Tris-HCL 缓冲液 Ph ( 内含 EDTA) 配制时配× 10 倍浓缩液 1000ml;NaCL; 聚已二醇;葡聚糖凝胶 Sephadex G-200 等; 实验器械与仪器设备:试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等;试剂瓶、层析柱、 pH 计和 pH 试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、 GL-20C 高速冷冻离心机、 DL-7A 大容量低速冷冻离心机二、操作步骤 1 .葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡(1 )柱材处理称取一定量的 Sephadex G-200 干粉,加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀 48h, 去掉悬浮的细微颗粒, 为防止凝胶颗粒中的空气存在, 影响层析效果, 凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉, 其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中, 进行抽真空处理, 直到凝胶液中没有气泡出现为止。(2 )装柱将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上,加 1/3 体积的无离子水, 打开下出液口, 水流畅通, 即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液( 凝胶的浓度过高会产生气泡, 影响蛋白质分离速度, 浓度过低易产生凝胶分层, 影响蛋白质的分离效果) 轻轻倒入层析柱中, 凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部, 凝胶沉积直到离层析柱上端 -2cm 处, 停止装柱, 剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵,下出液口连接蛋白质监测仪, 待层析柱的平衡。(3 )平衡在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡, 所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液( 洗脱液) 置换出来, 使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是: 利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内, 打开层析柱下端的出口, 平衡液流速在 -1ml/min , 当下出口流出液的 PH 值与平衡缓冲液的 PH 值一致时, 层析柱达到了平衡。在本实验中,用 Tris-HC L 缓冲液 ( 内含 EDTA) ,平衡 Sephadex G-20 0 凝胶。 2 .上样:将粗酶液上柱。 3 .洗脱:用 Tris-HCL 缓冲液 Ph (内含 EDTA ) 洗脱,收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰***凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。 4 .测定酶活性和蛋白质浓度注释:透析就是把( NH 4) 2SO4 透析出去三、实验结果取含有蛋白的洗脱液第 1至 19 管,每管含洗脱液约 5ml ,以供后续实验检测蛋白含量和酶活用。实验三实验蛋白质含量及活性测定一、仪器与试剂 1 .材料: 经硫酸铵沉淀获得 PPO 粗酶液, Sephadex G-200 分离纯化的酶液样品。 2 .仪器与器皿: 分光光度计,分析天平,容量瓶,移液管和试管等。 3