毕赤酵母表达系统.doc

毕赤酵母表达系统前言: 所用表达质粒有 ,pAO815 用于胞内表达,而 pPIC9K 用于分泌表达,所有载体均利用 AOX1 启动子来诱导高水平表达。抗性选择:最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对 HIS +转化子进行选择,再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。毕赤菌株表型: 毕赤酵母菌 GS115 及 KM71 在组氨酸脱氢酶位点( His4 ) 有突变, 因而不能合成组氨酸, 所有表达质粒都有 HIS4 基因可与宿主进行互补, 通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。 GS115 及 KM71 都可在复合培养基如 YPD ( YEPD )及含组氨酸的最小培养基中生长。转化之前, GS115 及 KM71 都不能在最小培养基中生长,因为它们是 His- 。培养温度: 毕赤酵母生长温度为 28-30 度(液体、平板、斜面)。在 32 度以上诱导生长时, 对蛋白表达有害,甚至会导致细胞死亡。贮存:贮存细胞几周或几月,用 YPD 培养基或 YPD 琼脂斜面 1 挑取所需菌株单克隆在 YPD 平板上划线生长;2 挑取单克隆转移至 YPD 进行穿刺培养, 30度 2 天; 3 细胞在 4 度可放几周几月或几年,存于- 80度 1 挑取所需菌株单克隆在 YPD 中过夜培养; 2 收集细胞,在含 15% 甘油的 YPD 中悬浮至终 OD600 为 50-100 ( 大约 - × 10 9 细胞/ml );3 细胞先用液氮或干冰/ 酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。注意: 在4 度或- 80 度长期保存后,用之前建议在 MM 、 MD 或 MGY 平板上划线培养以检测 His+ 转化子的表型是否正确及其活力。以质粒 pPIC9K ,酵母 Pichia pastoris GS115 为例说明做法。载体 pPIC9K 酶切为点线性化质粒 DNA : 建议使用下列方法线性化载体以获得 Mut+ 及 Muts 重组子,可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。如果只想得到 Muts 重组子,使用 KM71 菌株。单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得 Muts 重组菌(例如:插入 AOX1 或 his4 而不是取代 AOX1 )。如果插入片段含有下列任何限制性位点,见 p29-30 以替换位点。 1 如果克隆进 , 线性化时, 插入 AOX1 用 SacI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) ; 插入 HIS4 用 SalI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) 2 如果克隆进 pAO815 ,线性化时,插入 HIS4 用 SalI 或 StuI ( GS115, Mut+ 或 KM71, Muts ) 注意如果用 pAO815 载体,插入 2 个或更多拷贝子会产生 SacI 酶切位点 3 如果克隆进 Ppic9k , 线性化时, 插入 AOX1 用 SacI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) , 插入 HIS4 用 SalI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) 。 各种母液的配制 10*YNB( 含有硫酸铵、无氨基酸的 % 酵母基础氮源培养基)4℃保存。 34g 酵母基础氮源培养基(无硫酸铵) +100g 硫酸铵,溶于 1000ml 水中,过滤除菌。 500*B(% 生物素 Biotin)4 ℃保存。 20mg 的生物素溶于 100ml 水中,过滤除菌。 100*H(%Histidine 组氨酸)4℃保存。 400mg 的 L- 组氨酸溶于 100ml 水中, (加热至 50℃以促进溶解) ,过滤除菌。 10*D(20%Dextrose 葡萄糖) 200g 葡萄糖溶于 1000ml 水中,灭菌 15min 或过滤除菌。 10*M(5%Methanol 甲醇) 保存期为 2 个月。将 5ml 的甲醇与 95ml 水混匀,过滤除菌。 10*GY(10%Glycerol 甘油) 。将 100ml 甘油和 900ml 水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。 100*AA(% of each Amino Acid , 各种氨基酸)4℃保存。分别将 500mg 的 L- 谷氨酸、 L- 蛋氨酸、 L- 赖氨酸、 L- 亮氨酸和 L- 异亮氨酸溶于 100ml 水中,过滤除菌。 1M 磷酸钾溶液( potassium phosphate buffer , ) ,将 1mol/L 的 K2HPO4 溶液 132ml 与 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混匀,其 pH 为 , 如需调节 pH , 则使用磷酸和氢氧化钾调节 pH 。