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植物生理学实验七
实验七 植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验类型：基础验证型
实验学时：3学时
一 实验目的
1. 了解植物体内游离脯氨酸含量的变化，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，也可作为植物抗旱育种、抗寒育种的一项生化指标。
2. 学****测定脯氨酸含量的基本原理和方法。
二 实验原理
在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。
在酸性条件下，脯氨酸与茚三***反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在520nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。
三 主要仪器、试剂、实验材料
仪器设备：分光光度计，水浴锅，试管，
试剂:1 %酸性茚三***显色液：冰乙酸和 6M磷酸以3:2混合，
作为溶剂进行配置，搅拌加热（低于70℃）溶解，冷却后置
棕色瓶中，4℃保存可使用2~3d。
2 甲苯，3%磺基水杨酸溶液。
3 脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶
解，蒸馏水定容至250mL（100μg/mL）。再取10ml用
蒸馏水释定容至100ml （10μg/mL） 。
材料：植物叶片。
四 实验步骤
1．脯氨酸标准曲线制作：按下表操作
管号
0
1
2
3
4
5
6
标准脯氨酸/ml
0






H2O/ml






0
冰乙酸/ml
2
2
2
2
2
2
2
3%磺基水杨酸/ml
2
2
2
2
2
2
2
显色液/ml
4
4
4
4
4
4
4
脯氨酸含量/μg
0
2
4
8
12
16
20
混匀后在沸水浴加热60min，冷却，向各管加入4ml甲苯，充分震荡30S，静止片刻，以萃取红色物质，待分层后吸收甲苯层以0号管为对照在520nm下比色，作标准曲线。
2 样品的测定
（1）脯氨酸的提取：，加5ml3%磺基水杨酸研磨，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心10min。
（2），加2ml冰醋酸及4ml酸性茚三***试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。冷却，向各管加入4ml甲苯，充分震荡，以萃取红色物质，静止待分层后吸收甲苯层以0号管为对照在520nm下比色，得吸光度值。
五 结果计算
式中：C ：由标准曲线上查得的脯氨酸的质量，μg
V ：提取液总体积， mL
a：测定液体积， mL
W ：样品质量， g
注意事项
配置的酸性茚三***溶液仅在24h内稳定,***,显色液中茚三***的浓度要达到10mg/ml,才能保证脯氨酸充分显色.
测定样品若进行过渗透胁迫处理,结果会更显著.
此法也可用于干样品中脯氨酸含量的测定.