14-3-3gamma对神经元缺氧缺血损伤的保护作用及机制的研究.pdg.pdf.pdf

华中科技大学博士学位论文 1 14-3-3gamma 对神经元缺氧缺血损伤的保护作用及机制研究博士研究生:叶仕桥 导 师:陈晓钎教授 华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系 中文摘要 14-3-3 蛋白是 1967 年从牛脑中分离出,有 7 个亚型,它高度保守,广泛存在于真核生物中。其中 beta, epsilon, eta, gamma, zeta 在脑组织中含量十分丰富。 14-3-3gamma 主要在神经元表达。我们曾报道 14-3-3gamma 在体外缺血培养的星形胶质细胞中表达上调,并且通过结合磷酸化 Bad 减少缺血诱导的胶质细胞死亡。但是, 14-3-3 蛋白在神经元中保护机制至今尚不清楚。[ 目的] 研究 14-3-3 蛋白在缺血损伤的神经元中的表达,保护作用和机制。[ 方法] 通过基因重组技术构建 14-3-3gamma 干扰质粒,运用 LDH 释放实验, Western blot ,免疫荧光染色,免疫共沉淀以及原代神经元核转染等方法测定 14-3-3gamma 的表达,保护作用及机制研究,采用 CoCl 2 诱导的缺氧预适应方法研究在体 14-3-3 蛋白的保护作用。[ 结果] 我们发现原代培养的小鼠大脑皮层神经元缺血处理后 14-3-3gamma 表达明显增加。而 14-3-3beta , epsilon , eta 和 zeta 在相同处理下没有明显的变化。过度表达 14-3-3 特异结合蛋白( Diforpein )导致小鼠神经瘤母细胞( N2a )和原代神经元死亡增加。而过度表达 14-3-3gamma 显著减少缺血诱导的 N2a 和原代神经元的死亡。除此之外,我们在培养的 N2a 细胞和原代神经元中加入特异降解 14-3-3gamma 的 siRNA 也增加缺血诱导的细胞死亡。为了明确 14-3-3gamma 在缺血性损伤中的保护机制,通过免疫共沉淀方法,我们发现在原代培养的小鼠大脑皮层神经元经缺血处理后, 14-3-3gamma 上调并特异结合同时上调的丝氨酸 37 位点磷酸化 beta-catenin ,而它与 Ask-1 没有明显的相互作用。另外,我们还发现在过度表达 14-3-3gamma 的 N2a 细胞中, Bax 的表达明显下调;而过度表达 14-3-3gamma-siRNA 至内源性 14-3-3gamma 下调时, Bax 的表达增加。在氯化钴诱导华中科技大学博士学位论文 2 的缺氧预适应动物模型中,动物耐受缺氧存活时间明显延长, 14-3-3gamma 的表达上调,而其它 14-3-3 亚型发生不同的变化, Bax 和 p53 的表达没有明显影响。[ 结论] 上述结果表明,在缺血神经元 14-3-3gamma 表达上调并结合磷酸化 beta-catenin ,降低 Bax 的表达发挥减轻缺血神经元损伤的重要内源性保护机制,缺氧预适应导致内源性 14-3-3gamma 上调增加动物耐受缺氧。 关键词:14-3-3gamma , Bax , beta-catenin ,缺血,神经元,保护,缺血预适应 华中科技大学博士学位论文 3 Protective function and mechanisms of 14-3-3gamma on ischemic neurons . D. Candidate : Shiqiao Ye Supervisor : Prof. Xiao Qian Chen Department of Pathophysiology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology Abstract 14-3-3 proteins are abundant in brain tissues and the gamma isoform is mainly expressed in neurons. We have previous ly reported that 14-3-3gamma could be up-regulated in astrocytes by in vitro ischemia and attenuated ischemia-induced astrocytic death by binding to phosphorylated Bad. In this study, we studied the expression, function and underlying mechanism of 14-3-3gamma in ischemic neurons. The selecti