淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞定向分化为心肌细胞作用及其调控研究.pdf

:辎鴌、旷‘淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞定向分化为心肌细胞作用及其调控研究浙江大学药学院级博士研究生朱丹雁楼宜嘉教授浙江大学二零零五年五月导师专业药理学抽,.瓹:篜
淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞定向分化为心肌细胞作用及其调控研究中文摘要淫羊藿点诮阥敌￠蘅淫羊藿属ḿ觘斫“坍细胞,据此建立了体外心肌发生模型。这不仅促进了对体外心脏形成、早期心发育及组织器官生成过程,富含大量心肌发育依赖性生物信息。当药物诱导淫羊藿昔诱导小鼠胚胎干细胞定向分化为心肌细胞作甩墨基塑塑堑塞胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团或桑椹胚分离后,能在体外长期传代培养并保持高度未分化的全能细胞系。年锄等人发现在一定条件下,细胞可自发分化形成能自主跳动的心肌脏发育相关基因分化关键性环节、先天性心脏病发病机制和干细胞移植治疗的研究,而且也为评价化学物潜在胚胎毒性和致畸性提供了体外研究技术。但有关药物尤其是中药活性单体成分诱导细胞体外定向分化为心肌细胞效应却知之甚少。细胞及其体外定向分化体系能够基本模拟乃至重现体内心肌复杂的细胞定向分化时,可特殊地干预细胞内基因状况、转录调控、蛋白表达、信号转导等方面,高度模拟药物在整体动物的作用,重现药物与生物大分子作用时生命现象变化本质。采用高度末分化全能的细胞,并利用其在特定微环境下绾┪锏鹊奶跫嘌褐可定向分化为心肌细胞的特点,可探索某些心脏疾病发生起源的可能相关环节以及药物作用靶点。同时也为探索构建药效初步评价模型系统,有利于心脏疾病治疗药物发现及机制研究提供依据。将药物配合干细胞植入治疗心功能不全,可能促进移植的干细胞生存及定向分化为心肌细胞,这将成为心血管疾病细胞组织工程治疗的有效途径之一。植物,淫羊藿苷琁撬囊恢只仆\绽嗷衔铮魑8靡┎闹要有效成分之一,其主要药理活性在于改善心脑血管系统功能、增强机体免疫力及调节内分泌,同时还具有抗肿瘤、抗病毒等作用。已有文献报道,浙江大学博士学位论文珽
甀及活性代谢产物诱导细胞体外定向分化为心肌细胞的药效学研究治疗心脏疾病药物“心神宁”片剂的主要活性物质,具有补肾强心、宁心安神、养血除烦主要功效,适用于冠心病慕释矗募∪毖的治疗。但对其作用机制尚缺乏深入研究。本课题前期研究工作主要进行了迥谕獯恍形<其相关活性研究。本研究利用细胞体外定向分化为心肌细胞实验体系,着重探索了捌涮迥诨钚源晃镏识訣赴逋舛ㄏ蚍只P募∠赴盏夹应。并初步阐明榈糆赴ㄏ蚍只P募∠赴牡骺鼗疲荚诨袢其诱导细胞定向分化过程中核酸层面和蛋白层面的生物信息及转录调控、信号转导等过程,探索俜只饔冒械悖⑽=徊窖芯縄治疗心脏疾病或介入组织工程的药理作用提供依据。本研究采用经典的悬滴分化培养法,用蚱浠钚源徊镆蜣剿、去甲淫羊藿素诱导细胞体外定向分化成心肌细胞。药物终浓度分别是:~甃~;阳性对照药维阴性对照%。用倒置显微镜观察细胞分化情况,以细胞分化成具有节律性收缩的心肌细胞团为分化成功标志,并根据细胞分化成心肌细胞百分率作出量效关系和时效关系曲线供药效评价。实验结果显示,~~琁和诱导细胞定向分化为心肌细胞百分率分别为%.,%.ァH只衔中訣赴ㄏ蚍只P募∠赴哂凶罴延盏夹вΓ页氏忠欢啃Ч系和时效关系。当由细胞分化而来的拟胚体分别与~,一,.共孵育后,分化为心肌细胞百分率分别为%,%,%。而阳性对照组和阴性对照组的分化率是%和%。其中一。.组心肌细胞分化率显著高于阴性对照组.。时效关系研究显示,当盏寂ǘ任,,,在,玠浙江大学博士学位论文淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞定向分化为心肌细胞作用及其调控研究~、籱一:.ǎ籇甃:甃.
甀诱导细胞体外定向分化为心肌细胞的生物信息研究小节蛋白表达:并观察了分化后盼【∠赴涫毙孕вΑ只首罡撸ァG以诜只痙弦跣远哉兆樾募》只示拖灾提高。提示墒笶赴只P募∠赴氖毕嘞灾崆埃只氏灾高。基于上述药效学研究结果,为进一步探索盏糆赴逋舛ㄏ蚍只P肌细胞作用机制,本研究采用方法,检测了貳赴只P募∠胞过程中一系列心肌发育依赖性基因表达情况;用免疫荧光法鉴定了心肌特异性肌实验结果显示,在细胞定向分化早期纬赡馀咛逯,甃“隕赴卜跤,能显著上调心肌发育依赖性骨形成蛋白珺基因表达。当细胞经悬滴培养形成拟胚体,经。盏己螅诜只痙芟灾系餍募√匾煨宰B家蜃覰和泶铩K孀臝诱导细胞分化为心肌细胞百分率增高,、心室肌球蛋白轻链琈一蚿肾上腺素受体—泶镌龈撸鲜鲋副昃氏纸虾昧啃Ш褪毙Ч叵怠L崾綢促进细胞定向分化为心肌细胞与其促进心肌发育依赖性基因、⒉稫、甅、蚿泶镌黾酉喙亍免疫荧光实验结果显示,细胞经悬滴培养分化成具有节律性收缩的细胞,【图「频鞍譚。甃“艽俳只傻男募∠赴泶镄募√匾煨缘鞍住T谛募》⒂缙盏甲椋募∠赴⌒〗诘癳蛅色阳性率分别为%和跣远哉兆橹衋阳性细胞率是%