诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞方法学及其电生理特性研究.pdf

诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法学及其电生理特性研究中文摘要替,,应用跫嘌次諩华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科博士研究生祝武强曹林生教授目的『由于心肌细胞坏死不可逆转,心肌梗死后,早期再灌注治为坏死心肌修复开辟了新的途径。国外在胚胎干细胞细胞研究的进展;另外有关细胞分化心肌细胞电生理特性的报条件培养基代替白血病抑制因子,并尝试在不加任何诱导剂的情况法,并通过膜片钳技术研究离子通道电生理特性,为利用疗虽然能挽救濒死心肌细胞,但已经死亡的心肌细胞将由瘢痕组织代胎干细胞分化心肌细胞,浦,只笛榍安捎煤刈榘籽2∫种埔蜃拥呐嘌次諩细胞生长和抑制其分化,而重组白血病抑制因子价格昂贵,限制了道较少。本研究旨在应用布法罗大鼠肝细胞下,建立一种简单、经济、稳定的诱导细胞分化为心肌细胞的方移植修复坏死心肌打下基础。细胞生长和抑制其分化,并采取将悬滴培养法和聚集培养法结合起导师,学\
阶段缨墼撞菱中,不宣单独应用跫嘌胗肕饲期心肌细胞类似。≯一关键词胚胎干细胞;盆垂瞄心肌细胞:蝽荠:电生理来,分三步诱导细胞分化的方法。瓻赴此蘸蠓直鹋嘌通过细胞计数、拟胚体计数和细胞集落边缘细胞分化状态比较细胞在三种培养基中生长和分化差异。ü挤薮笫蟾蜗赴跫收集第天的并和培养的胚胎期小鼠心肌细胞~起做膜片钳天的干细胞分化心肌细胞钠通道、钙通道电流形态和通道特性与胚胎结论颐墙⒘艘恢治扌胩砑踊в盏技炼壹虮恪⒕玫诱导体外培养小鼠细胞分化为心肌细胞的方法。诟此蘸笤缙细胞钠通道、钙通道电生理特性类似。跫嘌⑿∈笈咛コ上宋赴饲养层及合并应用跫嘌蚆饲养层的环境中,培养基和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养细胞,经过诱导分化,实验,比较两种细胞离子通道电生理特性。结果瓻赴只6嘀中翁南赴渲锌杉诼尚允账的细胞,经超微结构分析和免疫细胞学鉴定为心肌细胞。隑组比较,;楹虰组无明显差异。养层或合并应用跫嘌蚆饲养层。瓻赴只程中出现离子通道功能表达,干细胞分化心肌细胞与胚胎期小鼠心肌√华中丰¨笱蠹靡窖г■&弭士中位工,/,,‘、
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方法的研究第一部分诱导体外培养小鼠胚胎千细胞分化为心肌细胞小鼠胚胎千细胞,切∈笤缙谂咛サ内细胞团,或桑椹胚分离建立的具有发育潜能性的细胞系【”。细胞的基本特点是既能在体外增殖,又能维持不分化状态和发育潜能性。把细胞注射到小鼠胚泡中能参与发育形成嵌合体鼠,能分化成小鼠胚胎的各种类型细胞,包括生殖细胞等,甚至整个胚胎几乎完全来源于细胞】谔逋庥盏继跫拢珽赴能分化成各种细胞系【縪目前有关诱导细胞分化为心肌细胞的方法报道甚少。等贓赴只笛榍安捎煤刈榘籽2∫种因子呐嘌次諩赴ず抑制其分化,而重组鄹癜汗螅拗屏薊赴芯康慕埂A外在是否需要在培养环境中加入一定的化学物质作为诱导剂的问题上各家报道不一1臼笛槟庠谟盏挤只笛榍埃τ貌挤薮笫蟾细胞条件培养基,简称条件培养基鍸,从而降低实验成本,并尝试在不加任何诱导剂的情况下,采取将悬滴培养法和聚集培养法结合起来,分三步诱导细胞分化,目的在于建立一种简单、经济、稳定的诱导细胞分化为心肌细胞的方法。Ы
材料和方法培养基中,置。%嘌渲信嘌话忝天传代巍饕2牧胎牛血清鹤院贾菟募厩嗌锕こ滩牧嫌邢薰尽培养基、含高糖的培养基、匣掖⒐劝滨0⒁鹊鞍酌、明胶鹤匝欠ㄉ锊料有限公司。染色试剂盒和陨约梁泄鹤圆┦康律工程有限公司。丝裂霉素购自尽细胞、—细胞由中科院上海细胞所丛笑倩教授惠赠。/∈蠊鹤员拘J笛槎镏心。瓸条件培养基制备赴此蘸笠赴痬又钟诤的扩增后的赴×痬又钟目ㄊ掀恐校入含的,每焓占次细胞培养基,一般可持续堋J占呐嘌痳胄匀コ赴恋怼准备常规细胞培养基,成分为%.疞约昂咛堑腄=鲜鯞赴置谝与常规细胞培养基以//比例混合,,.疞,即得到跫嘌基。∈/∈螅∨咛ゲ⑷ネ凡亢透卧啵肈狹/华中科技学虎
细胞/保握蘸铝⒌确椒╗浚./丝裂霉素处养基洗涤危浼羲楹笮∮贒嘌校米昂号针头的医用注射器吹打我苑掷胂赴仓闷毯笕∩喜阆赴弃组织块沉淀,离心洗涤危×/接种于含%的培养基中,置%嘌渲信嘌话忝天传代危代以前的捎米鏊茄恪4谂嘌腗长至约理贴壁培养的,使细胞失去分裂增生能力,用瓾液洗涤危缓蠹尤牒的培养基备用,即为小鼠成纤维细胞,饲养层。丝裂霉素处理过的茄阕詈迷天内使用为宜。∈笃废天胎龄的囊胚内细胞层细胞分离建系,是一株具有多向分化潜能的细胞【8此蘸笠—/接种于预先铺有茄愕呐嘌恐校捎肂条件培养基进行培养。细胞置于℃,培养箱中。一般每齑ù次。在诱导分化实验前,