TaqMan探针实时荧光定量RTPCR法检测SIVSHIV病毒RNA拷贝数方法的建立及应用.pdf

TaqMan探针实时荧光定量RTPCR法检测SIVSHIV病毒RNA拷贝数方法的建立及应用.pdf中英文缩略表 AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome获得性免疫缺陷综合症 SIV Simian Immunodeficiency Virus 猴免疫缺陷病毒 SHIV Immunodeficiency Virus人/猿嵌合免疫缺陷病毒 HIV Human Immunodeficiencv Virus 人免疫缺陷病毒 PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells 外周血单核细胞 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction OD EB Ct TAMRA Optical Density Ethidium Bromide Cycle Threshould Tetramethycarbodamine 7 逆转录聚合酶链反应光学密度溴化乙锭阈值循环数四甲基, RT--PCR检测方法,该方法简便、特异、灵敏、重复性好,为我国SIWSHIV 动物模型的研究及艾滋病疫苗评价和应用中病毒载量的测定提供了理想检测方法。病毒核酸的定量主要有三种方法:支链DNA检测法(bDNA)、实时荧光定量PCR技术( PCR)及核酸序列依赖性扩增法(NASBA)。其中real—timePCR的应用范围非常广泛,包括mRNA表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定以及病毒感染的定量监测。鉴于real—timePCR的特异性强,灵敏度高、简便快速等优点,在本研究中,为了测定SIV/SHIV/SAIDS恒河猴血浆病毒RNA载量,建立了 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,对本室SIV/SHIV病毒RNA定量外标准品(RS)进行定量分析,优化反应体系,测定标准曲线和定量曲线, 并检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。同时将该方法与本室建立的SYBR Green I荧光定量RT—PCR方法进行比较,对同样的RS标准品进行检测。实验结果证明,相同浓度的RS 标准品TaqMan探针方法测得的Ct值较高,但该方法检测灵敏度可达 1,0x10’copies/此,特异性及重复性良好,对同一样品进行16次重复检测,,达到了很高要求。在成功建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的基础上,对 SIVmac239、SIVmac25 l毒株攻毒恒河猴和SHIV-KB9攻毒恒河猴血浆中 RNA病毒载量进行了跟踪检测,探讨TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法和病毒分离结果及SYBR Green , 并比较其优缺点。结果显示在SIVmac239、SIVmac251及SHIV-KB9感染期间,该方法可检测到的恒河猴血浆病毒载量最高达到108copies/mL,检出下限为103copies/mL,与SYBR Green I荧光染料检测方法进行比较后证明,两种方法测得的病毒载量数量级一致,数据没有很大的偏差,且该方法的灵敏度及稳定性明显高于同时进行的SHIV-KB9感染恒河猴的病毒分离实验。【关键词】实时荧光定量RT-PCR;TaqMan探针:猴免疫缺陷病毒(sIv): 人/猿嵌合免疫缺陷病毒(SHIV);恒河猴模型;病毒载量。 ABSTRACT There are mainly threemethods todetectviralload:bDNA,real—time PCR and -time PCR technique is used extremely widespread, including mRNA expression research,DNA copy number examination,single nucleotide polymorphism(SNPs)determination as well as quantification monitoring of virusinfection. Inthisresearch,a real—timequantitative RT—PCR method was developed withTaqMan probe to assess theplasma vires RNA load ofSIV and SHIV based on thesensitivity,specificity and simplicity merit