引物设计常见问题.doc

引物设计常用问题与解答(二)
17. 长链引物为什么出错几率非常高？
答：引物合成时，每一步反映效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变因素客观条件均有始终存在。引物链越长，突变频率累加起来就越高。研究人员总但愿合成引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不也许绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不也许保证100%对的。要懂得，引物合成中发生错误（非人为因素）频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中某些引物也许有突变思想准备。
18. 如果测序发现突变，该如何解决？
答：对您遇到困惑，咱们表达同情。遇到这种状况，一方面和咱们获得联系，咱们生产人员会检查生产原始记录，重要是核对合成序列与否和定单一致，咱们在电脑中保存所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，咱们建议重新挑取克隆测序，您也许会找到对的克隆。依照咱们经验，40个碱基如下引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上特别是用于全片段拼接合成，就需要多测某些了。普通状况下，每个克隆突变位点都不同样，提示对的总是有，就是如何找到它。您也可以规定咱们将引物免费重叠一次，但是重叠引物和第一次引物同样，都也许含突变，不会由于重叠引物就减少您遇到问题几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几种，否则就重叠一下引物。
19. 如果测序发现引物突变，与否有补偿？
答：没有。咱们可以免费重叠一次，没有其她任何补偿或补偿，不承担其她连带责任。因素咱们在前面已提到，化学合成效率不也许达到100%.您选取了化学合成引物，合成过程中某些副产品所带来后果就也许不可避免遇到。
20. 引物是通过PAGE纯化，为什么尚有碱基缺失或插入？
答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区别引物之间一种碱基差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时条带非常宽，带与带之间有重叠，辨别率已下降，电泳后割带回收目引物时，很难说不割到差别仅几种碱基引物。国内有一种不好现象，PAGE纯化引物，特别是长引物要量都比较高，导致割条带有时也许比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到问题也许就会少某些。
21. 为什么OPC或PAGE纯化引物，再用HPLC鉴定纯度不高？
答： 有些顾客引物需要纯度特别高引物，在使用前会将HPLC鉴定引物纯度，经常发现引物纯度普通在70%左右。问题来了，尚有那30%是什么？ 引物纯化PAGE，需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。沉淀得到核酸物质基本引物了，除此以外，尚有其她某些非核酸类物质，她们普通不会干扰引物使用。OPC纯化也类似状况。虽然是HPLC纯化引物，如果对成品进行分析，普通也难达到很高纯度，引物您得到纯品都是由制备柱过来，洗脱峰通过浓缩抽干，某些非核酸物质被富集。
22. 为什么修饰引物产量要比普通引物低，价格要高？
答：重要由于是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到产量自然低于普通引物。修饰引物普通需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用原料是普通引物原料几百倍，因此产品价格自然高
23. TaqMan 探针设计基本原则是什么？
答：下列原则供您参照。
◆TaqMan 探针位置尽量接近扩增引物（扩增产物50-150b