实时荧光定量PCR检测感病蝗虫.doc

实时荧光定量 PCR 检测感病蝗虫体内绿僵菌 rDNA 基因* 中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2005, 25(11):71 ~ 75 张清平 1,2 彭 1,2,3 夏玉先 1,2,3** (1 重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室重庆 400030) (2 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心重庆 400030) (3 重庆大学生物工程学院重庆市杀虫真菌工程技术中心重庆 400030) 摘要根据绿僵菌 23S rDNA 的转录间隔区( ITS )和 的基因序列,设计检测感病蝗虫体内绿僵菌菌体 DNA 分子的特异引物, 通过优化感病蝗虫菌体 DNA 快速制备方法, 建立了基于荧光定量 PCR 的定量检测体系。该检测方法专一、灵敏,检测下限为 10pg/ μl 绿僵菌,并且能从刚侵染 48h 的东亚飞蝗血淋巴中,早期定量检测到在虫体血淋巴中增殖的绿僵菌的 rDNA 。关键词绿僵菌蝗虫定量检测实时荧光定量 PCR 收稿日期: 2005 04 18 修回日期: 2005 09 01 * 国家“ 863 ”计划资助项目(2004AA246050) ** 通讯作者, 电子信箱: ******@cgu. 绿僵菌作为蝗虫的重要病原真菌, 已广泛应用于蝗虫防治。绿僵菌生物制剂已被世界粮农组织( FAO )推荐为环保产品,在非洲和澳洲以及中国大面积推广应用于蝗虫的生物防治[ 1,2 ]。类似于触杀性杀虫剂, 附着在虫体表面的绿僵菌孢子必须萌发、形成芽管和附着胞, 穿透寄主体壁侵入蝗虫体内, 以菌丝段或虫菌体等形态存在于寄主的血淋巴中[3]。虽然昆虫病原真菌的致病机制十分复杂, 但是病原真菌菌体在寄主体内快速增殖是使寄主昆虫罹病、死亡的前提, 其增殖数量及速率直接影响病程及杀虫效率。病原真菌在寄主体内的生长繁殖情况能够直接反映致病进程, 可成为杀虫真菌菌株及其制剂毒力评价的重要指标。传统的真菌检测方法难以快速定量检测昆虫体内复杂环境中的真菌,不能满足相关研究需要。实时定量 PCR 已成功地用于定量检测人体病原真菌、环境真菌、植物病原真菌等。 Gachon 等( 2004 ) 利用实时定量 PCR 监测植物病原真菌在寄主体内的生长情况, 将病原真菌在寄主体内的早期生长量作为评价植物病原真菌的致病性指标。建立实时荧光 PCR 定量检测昆虫体内绿僵菌的体系, 可以早期定量检测东亚飞蝗体内病原真菌的数量, 确定病原真菌在东亚飞蝗体内的增殖速率和动态变化, 对于昆虫病原真菌的致病机理研究、真菌生防制剂配方优化都具有重要意义。 1 材料与方法 材料供试菌株:绿僵菌(Metarhizium anisopliae) 菌株 CQMa102 ,为杀蝗专一菌株, 分离自重庆缙云山自然感病的黄脊竹蝗( Ceracris kiangsu ) ,保存于重庆大学基因工程研究中心。供试蝗虫:东亚飞蝗[ Locusta migratoria manilensis ( Mey ) ]新羽化雄成虫,由重庆大学基因工程研究中心昆虫室提供。 试剂与仪器蜗牛酶、崩溃酶( 北京鼎国生物技术发展中心), 蛋白酶 K( MERCK ), 十二烷基磺酸钠(SDS , Bio Rad) , iQTM