实验16-酶切与连接.ppt

成都医学院-生化与分子生物实验实验十实验十限制性酶切与连接限制性酶切与连接成都医学院-生化与分子生物实验一种能够结合外源 DNA 片段形成重组 DNA ,并能进行自我复制的 DNA 分子称为 Vectors. 主要载体:质粒、噬菌体、病毒按功能分类:克隆载体(构建基因组文库或 cDNA 文库)、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。随着生物技术的发展和科学研究的深入,不断出现具有不同功能的新载体,如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。载体( Vectors ) 结构的三大要素: ?多克隆位点?选择标记(耐药性, LacZ ) ?独立的复制单位由 pUC18 改造而来,大小为 3162bp 。相当于在 pUC18 中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。(二)材料?模板 DNA ?引物: APO A1-GST2( 载体: pGEX-6P-1) PrimerGST6p1-APOA1-Up: 5’ G GAATTC ATG -3 ’ EcoRI PrimerGST6p1-APOA1-down: 5’ CGC GTCGAC TCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3 ’ SalI 粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如 Eco RI的识别顺序为: 5 ’…… G| AATTC …… 3’ 3 ’…… CTTAA | G …… 5’在双链上交错切割的位置切割后生成 5 ’…… G AATTC …… 3’ 3 ’…… CTTAA G …… 5’各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA 连接酶的作用而“粘合”。成都医学院-生化与分子生物实验成都医学院-生化与分子生物实验一、 DNA 的限制性酶切实验原理?核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,功能犹似高等功物免疫系统, 用于抗击外来 DNA侵袭。?限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键, 产生的DN***段5 ’端为P,3 ’端为OH。成都医学院-生化与分子生物实验?根据限制酶的识别切割特性, 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。?第一类( I型)限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序,在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链,切割核苷酸顺序没有专一性,随机。这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。这类酶如 EcoB 、 EcoK 等。?第三类( III 型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段,具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。 1. 限制性内切酶的类型成都医学院-生化与分子生物实验?第二类( Ⅱ型)限制性内切酶就是通常指的DNA限制性内切酶. ?它们能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内进行切割, 产生特异的DN***段; ?Ⅱ型酶分子量较小,仅需 Mg 2+作为催化反应的辅助因子,识别顺序一般为4~6个碱基对的反转重复顺序; ?Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口--5 ’端突出、3 ’端突出和平末端。?限制性的内切酶的发现和应用, 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造,从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。 1. 限制性内切酶的类型