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第七课样品的全息制备.ppt


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第七课样品的全息制备
现在学****的是第1页,共78页
蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步,无论后续采用
怎样的分离或鉴定手段,样品制备都是关键步骤。从蛋白质
组大规模研究的角度而言,要求样品制备尽可能获得所有的
蛋白质,用。
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(二)还原剂
还原剂(reducing agent)主要是用来断裂蛋白质分子中
Cys残基之间形成的二硫键,增加蛋白质的溶解性。常用的
还原剂有β—巯基乙醇、DTT或DTE(Dithioerythreit01)和
三丁基膦(TBP)等。其中DTT是使用比较广泛的还原剂,它
在50mmol/L时能有效地还原大部分的二硫键,但有些蛋
白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高DTT的浓度,
由于它的pKa在8左右,因而会影响到pH梯度。另外,DTT
在碱性pH值下会发生去质子化,在等电聚焦时,向阳极发
生迁移,使得阴极的DTT损耗而不足,导致二硫键复原,蛋
白质沉淀。而非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效,能大
大增加蛋白质的溶解性,在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以
还原。
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(三)去污剂
去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作
用,提高蛋白质的溶解性,防止在等电聚焦时析出。去污剂
有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去
污剂有阴离子去污剂SDS,非离子去污剂TritonX-100和NP-
40,***离子去污剂CHAPS等。原则上去污剂应该是非离
子型或者是兼性离子型,这样才不会影响蛋白质迁移到它们
各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦,
然而由于SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降
解,并提高了蛋白质的溶解性,特别是膜蛋白的溶解性,因
此一般只用于样品处理的初级阶段。在SDS浓度不高于0.3
%时,对等电聚焦不会产生太大的影响。现多数以兼性离子
去污剂CHAPS代替。CHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基
酸残基的能力更强,其使用浓度一般在1%~2%。然而它在
高浓度脲中的溶解度比较低,因此不断有新的去污剂涌现出
来。
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(四)***电解质载体
在去污剂存在的情况下,某些蛋白质在等电聚焦的时候仍
旧容易沉淀在它们的等电点上。为了防止这种现象的出现需
要向蛋白质溶液中加入某些盐类以增加蛋白质溶解度,但是
与此同时这些盐类又会使聚焦效果不理想。为了解决这个问
题,通常在缓冲液中加入***电解质作为载体。***电解质
能够促进蛋白质的溶解,吸附高浓度尿素在溶液中形成的***
酸盐离子(cyanateions),离心时还有助于核酸的沉淀。此
外,它还可以阻止样品蛋白质和IPG胶条中固相化的***电
解质相互作用。一定浓度的***电解质会提高蛋白质溶解
性,在第一向等电聚焦时,提高极性端蛋白质的聚焦效果。
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以上介绍的是常规使用的各种裂解液成分对样品蛋白质的
作用,保证蛋白质达到最大的溶解度并适合双向凝胶电泳。
关于裂解液的配方,由于不同实验室有着不同的****惯和需
求,配方也千差万别。Gorg总结了三种裂解液的配方:
①9mol/L脲,1%(m/V)DTT,2%-4%(m/V) CHAPS,2%
(V/V)***电解质,pH3-10和10mmol/L Pefabloc蛋白酶抑
制剂。
②7mol/L脲,2mol/L硫脲,1%(m/V)DTIT,2%~4%
(m/V)CHAPS,2%(V/V)***电解质,pH3~10和10mmol
/L Pefabloc蛋白酶抑制剂。
③热的SDS缓冲液:1%(m/V)SDS,100mmol/LTris-HCl,
pH7.0,该缓冲液裂解样品后至少3倍稀释于1或2的裂解液中。
根据目标蛋白质的特性和实验要求,我们同样可以摸索出
更合适的裂解液配方,进行有效重复的样品制备。
现在学****的是第12页,共78页
三、 双向凝胶电泳常规样品制备
样品制备时要使用新鲜的样品或者将新鲜样品速冻(液氮
或—70℃)保存;注意防止污染,佩戴乳胶手套等。整个操
作过程在冷库或冰浴中进行,避免蛋白质的降解、修饰。
下面以最简单的培养细胞的样品制备为例,介绍操作步骤
如下。
①常规细胞培养,待长至80%左右密度时,在处理前一天更
换新鲜培养液。
②吸去培养液,用预冷PBS清洗细胞,重复3次。
③按1 X 106细胞加50t~l的量往培养皿中加裂解液(8mol/L
Urea,4%CHAPS,40mmol/LTris,65mmol/LDTT),
刮刀收集。
④进行超声波处理,处理时间为5s,间歇时间为10s,功率
为100~120W,超声处理至

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  • 时间2022-01-23