双荧光素酶报告实验.doc

双荧光素酶报告实验.doc双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验
实验名称： 双荧光素酶报告实验
实验基础知识： 荧光素酶（英文名称： Luciferase）是自然界中miRNA 对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定
miRNA 与靶基因 3’UTR 的作用位点。
从这两个图谱中可以发现， ppGL3-Basic 这个载体主要是用于评
miRNA 与靶基因 3’UTR 的结合，靶基因的 3’UTR 放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶， 而 pRL-TK 这个载体则表达海肾荧光素酶， 将这两个质粒共同转染进入 293 细胞中来检测荧光时， pRL-TK 这个质粒起到一个内参的作用。
3、pmir-GLO 将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体
上，偏差更小且单质粒转染比双质粒共转染更简单。该质粒也是由
promega 公司开发的，图谱如下所示：萤光素酶是理想的报告基因，
因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶， 一旦转录完成立刻就生成
功能性的萤光素酶， 同时在所有的化学发光反应中， 它的光产物具有
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验
最高的量子效率，检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于
miRNA 靶基因验证。
荧光素酶报告基因的原理在于 miRNA 主要通过作用于靶基因
3’UTR 起作用，可以将目的基因 3’UTR 区域构建至 pGL3-basic
载体中报告基因 Luciferase 的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定 miRNA 与靶基因 3’ UTR 的作用位点。
同时，为了减少内在的变化因素，比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响， 将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase ）的质粒（ phRL-TK ）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞， 提供转录效率的内对照， 使测试结果不受实验条件
变化的干扰。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂 Luciferase Assay Reagent II时产生萤火虫荧光信号， 这样先测量萤火虫荧光素酶
活性。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入 Stop&Glo
Reagent 试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进
行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。
实验检测步骤：
一、样品准备：
质粒转染细胞
（ 1）细胞铺板：将细胞按 50%的密度接种到细胞培养 12 孔板内。
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2）转染：16h 左右细胞约 70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置 3 个复孔。首先设计四组：
双荧光素酶报告实验
双荧光素