碱性磷酸酶的分离纯化鉴定课件.ppt

关于碱性磷酸酶的分离纯化鉴定
现在学****的是第1页，共20页
分离纯化的一般程序
选择材料
破碎细胞
提取
分离纯化
分析及鉴定
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AKP溶于30%乙醇、33%***（上清中）， AKPbsorption spectrometry）。
不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来
现在学****的是第8页，共20页
（一）基本原理
光具有波粒二相性。
波长和频率是光的波动性的特征。
1、光的基本知识
紫外分光光度计（200－400nm）
可见光分光光度计（400－760nm）
红外分光光度计（760－1000nm）
现在学****的是第9页，共20页
2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
A ＝ K·L·C
吸光度 (Aabsorbance,A )
消光度 (degree of extinction,E )
光密度 (optical density,D )
K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。
现在学****的是第10页，共20页
对比法进行定量分析
A样 = K · L · C样
A标 = K · L · C标
A样
A标
K · L · C样
K · L · C标
C样
C标
C样 = A样· C标 / A标
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单色光、平行光（λmax）
溶液均匀、清澈、无散射
溶液性质稳定，比色皿中无化学反应
适用于稀溶液（A -）
Lambert—Beer定律的适用范围：
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溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。
试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这种方式最为常用。
参比溶液的选择
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基本组件及常见分光光度计
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分光光度计的使用
1. 打开电源预热15分钟
2. 选择波长（ λmax ）
3. 光标指向Trans
4. 打开光门，调节0％；关上光门调节100％
5. 重复4一次
6. 将光标指向ABS
7. 读数
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磷酸苯二钠
碱性磷酸酶
苯酚 + 磷酸盐
碱性
苯酚 + 4-氨基安替吡啉 + 铁***化钾
红色醌式化合物
AKP活性测定基本原理－－磷酸苯二钠法
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单位（ml）
空白管 标准管 A B C D
各阶段稀释液
酚标准液（）
Tris-醋酸镁
复合底物液
/ /
/ / / / /
/ / / / /
3 3 3 3 3 3
酶活性单位 （U/ml）=
A样
A标
× ×稀释倍数
37保温 15分钟
各管加入铁***化钾液2ml，静置15min
510nm 比色
酚标准液浓度
稀释倍数 ( ） / / 25 10 5 1
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蛋白含量测定基本原理－－BCA法
蛋白质+Cu 2＋
碱性
BCA试剂
紫色化合物
Cu＋
二喹啉甲酸，BCA
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单位（ml）
空白管 标准管 A B C D
各阶段稀释液
蛋白标准液（）
蒸馏水
BCA试剂
/ /
/ / / / /
/ / / / /

蛋白含量（mg/ml） =
A