分子生物学课件.ppt

分子生物学课件
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PCR技术是一种体外模拟体内DNA复制过程的核酸扩增技术。它是以待扩增的双链DNA为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物，以四种dNTP为底物，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，经过 序列2：tg c atgcatgcatgc 序列3：tg t atgcatgcatgc
若样品并不能明确是1，2还是3，为了能从不确定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引物实际上就是针对序列1，2，3设计的混合物。这样不论是1，2还是3，采用你的引物均能有效扩增。
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套嵌引物
设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。
1
3
2
4
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引物的溶解与保存：
① 高浓度贮存分装，避免反复冻融,临用前稀释
②－20℃贮存
引物量：

～1umol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶
① 热稳定性
最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
② 最适温度高
最适温度： 74-80 oC (PCR延伸：72℃-）
延伸速度： 约35-150nt/
最长延伸长度：
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③ Taq酶的功能缺点
具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。
因此不能修复错误的碱基配对！
合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。
金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。
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1. 不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。
2. 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少.
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底物：dNTP
1. dNTP小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，不能低于10～15μmol/L。浓度过高，与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低，抑制Taq DNA聚合酶的活性。浓度过低又会降低PCR产物的产量。
尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。降低合成速度，过早终止反应。
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模板(靶基因)
要求：
1. 100l反应体系中质粒DNA 1-10ng，基因组DNA 50-100ng 足够。
2. 纯度要求不太严格，可以是粗品，但不能混有SDS、有机溶剂酚、***仿等蛋白质变性剂以及任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。
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模板的种类：DNA或RNA。
1. RNA：先通过反转录得到cDNA。
2. 质粒：线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。
3. 高分子量的脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核糖核酸）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。
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Mg2+
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。
Mg2+可以与dNTP结合，易化4种dNTP的协作，而且可以促进和稳定引物-模板的相互作用。因此，Mg2+浓度过高，可出现非特异扩增。
浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+～。
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PCR反应条件的选择
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。标准反应中采用三温度点法
对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
----- 温度与时间的设置
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①变性温度与时间：
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃