Bmi-1质粒载体构建.doc

....Bmi-1基因过表达载体的构建【摘要】目的:在真核细胞中构建Bmi-1基因的过表达载体。方法:从GenBank中获取Bmi-1基因序列,设计针对Bmi-1的特异性引物,利用PCR方法获得全长目的基因,将目的载体和PCR产物进行双酶切,在T4DNA连接酶下形成重组质粒。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的即为构建成功的目的质粒。结果:经阳性克隆测序结果及结果分析,测序正确。结论:人源Bmi-1真核过表达载体构建成功。【关键词】Bmi-1;过表达载体;转化前言:多梳基因(bgroupgenes,PcG)家族是果蝇发育时维持同源异形基因稳定表现的重要因子。在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞的维持中有着重要的作用。由荷兰癌症中心于1991年在鼠淋巴瘤中发现的Bmi-1基因(Bcell-specificMLVinte-grationsite-1)是多梳基因家族中重要成员之一,参与干细胞的增殖、分化与衰老,在多种肿瘤形成过程中起重要作用[1]。人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区(该区域被认为与各种白血病染色体易位有关),,mRNA为3199bp,含10个外显子,编码含326个氨基酸的蛋白质,[2]。其蛋白表达在细胞质、染色质或染色体。Alkema等用鼠Bmi-1cDN***断作为探针从人白血病细胞中分离出Bmi-1并进行分析,发现其核苷酸序列与鼠的一致性达86%,所编码的蛋白质的氨基酸系列与鼠的一致性达98%。Bmi-1基因含有一个环指模序,位于N-末端的环指结构域(ringfin-gerdomain,RF),与抑癌基因c-Myc协同在细胞增殖和肿瘤形成中发挥作用。Bmi-1通过环指结构与其他环指蛋白,如dinG等形成异源二聚体,再与其他成分相互结合,抑制其靶基因的转录[3]。Bmi-1基因还含有一个位于中心的保守DNA结合模序螺旋-转角-螺旋-转角(DNAbandinghel-ix-turn-helix-turnmotif,H-T-H-T),起转录抑制作用。研究表明,这两个结构在细胞生存期的延长和抑制p16上是不可或缺的,敲除这两个结构,Bmi-1基因即会失活,导致早衰。1材料与方法....;250bpDNAladderMarker来源于捷瑞公司;琼脂糖来源于赛百盛公司;限制性内切酶来源于NEB公司;In-Fusion?PCRCloningKit来源于clontech公司;Taqpolymerase来源于SinoBio公司;dNTP来源于Takara公司;Primer来源于捷瑞生物公司;Plasmid抽提Kit来源于Promega公司。-EGFP-MCS-SV40-Neomycin的GV144载体酶切,其克隆位点为:XhoI/BamHI。(5154-2)-AGAAGAAGTTGCTGATG的引物BMI1(5154-2)-P2用于PCR钓取目的基因并进行电泳。,PCR对序列为AATCTAAGG