药物诱导K562及HEL细胞珠蛋白基因表达前后细胞微小RNA的分离鉴定.pdf

第一军医大学
博士学位论文
药物诱导K562及HEL细胞珠蛋白基因表达前后细胞微小RNA的分
离鉴定
姓名:李西平
申请学位级别:博士
专业:儿科学
指导教师:钱新华;姚英民
20040601
英文缩略词表碱基对异丙基硫代一籇一半多聚酶链反应英文缩写英文全称中文全称摄氏度纺褴账幔旱チ姿峄纺褴焦碳酸二乙酯二***亚砜脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷酸乙二***四乙酸克,重力加速度乳糖苷摩尔每升位点控制区磷酸盐缓冲液聚乙二醇酸碱度转录后基因沉默一氧化氮℃溴化乙锭血红蛋白微升毫克分钟毫升毫摩尔每升小时,猙狣—
核糖核酸转每分钟十二烷基硫酸钠可溶性鸟苷酰基环化酶琋,琋’一四***乙二***微摩尔每升讳逡一***一贿胚核糖核酸酶逆转录蝗羌谆被淄单位一狣一半乳糖苷琋,琋’琋,畉/猤·—畊
摘要地中海贫血在世界范围内分布广,发病率高,危害大,长期以来其相关研究一直是生物医学研究的热点。重型刂泻F堆?梢员灰斐8表达的蚋纳屏俅仓⒆吹南窒螅偈箍蒲Ъ椅谱湃绾巫鑜上恢榈白基因向恢榈鞍谆蚯谢患叭绾沃匦录せ钜亚饔诠乇盏腨一珠蛋白基因等问题开展了各种各样的研究工作。。某些药物如羟基脲、丁酸盐等可以诱导恢榈鞍谆蛑匦卤泶铮诹俅灿τ霉讨腥闯氏出个体差异。研究发现,羟基脲可使增加,后者可能影响某些转录因子而干预恢榈鞍谆虮泶铩6∷嵫慰梢种谱榈鞍兹ヒ阴;傅活性,还可以通过抑制⒓せ頿信号转导通路而诱导细胞向红细胞系分化。但其作用机理还有待进~步阐明。近年来人们发现了一种新的基因调节因子一微小N⑿的片断大小在~左右,包括及属于膕。它们引起与其碱基互补的降解或翻译抑制,表现为基因转录后沉默。已经在包括人类在内的许多生物体发现了它们的存在。它们的功能涉及到基因组印记、扇拧⒆B嫉骺丶把≡裥约羟械榷喔隽煊颉T小鼠骨髓造血细胞的分化过程中也发现有牟斡搿T谝┪镉盏泶锏墓讨校欠裼衜的参与,目前还未见相关报道。尤其是人红白血病细胞,在羟基脲及丁酸盐诱导下发生了向红细胞系欠褚膊斡肫渲心另一株人红白血病细胞梢栽隰腔诱导下发生榈鞍谆虻淖B迹诘鞍字仕饺次蘅杉觳獾降腂一肽链,这属于转录后基因沉默,具有这一调节功能的微小欠褚细胞中分离微小云诜⑾挚赡懿斡胗盏糦、恢榈鞍谆虮泶锏J酝嘉V榈鞍谆虻骺鼗频难芯垦罢倚碌耐黄瓶凇第一步,我们对细胞在羟基脲及丁酸盐作用下、赴的分化,在个体发育及组织细胞分化过程中具有调节基因表达功能的参与其中A私饩稣庑┮晌剩颐鞘酝即佑靡┣昂驥赴癏反向作用因子,如:癎猯、、、猯
羟基脲作用下发生向红细胞系分化的现象进行了验证。结果:在羟基脲及丁酸盐作用下,细胞联苯***染色阳性细胞数在第小时及第小时,均较未用药组显著增加。.觳庥靡┳镚榈鞍谆虮泶***染色结果与未用药组相比无变化,但在第小时用药组细胞出现可检测到的恢榈鞍谆虮泶铩Q≡穸砸┪镉盏挤从玫挠靡第小时的细胞作为第二步的研究对象。第二步,我们进行了微小姆掷胗爰üぷ鳌7椒ǎ捍笈颗作为内对照。测序胶分离及回收瓯局衅洗笮∥挥微小NN⑿的思’端分别加猂嵌合体接头,以为微小’及艘牍餐蛄小2庑蚪悍掷牖厥粘晒μ砑咏油返产物。回收的微小璕甈扩增,经上下游引物为锪缸饔孟滦纬伤婊澹悍掷牖厥涞钠稀用自制的超高效惺芴妇凶;及酶切法筛查含插入盐诱导组鲋柿#琄赴腔逵盏甲个质粒,赴从靡组觯琀细胞羟基脲诱导组鲋柿=欢锛际豕静庑颉W终橄赴目寺」驳玫个新希篴基脲组测到危琀细胞未用药组测到。峡梢栽谌死嗷蜃檎业酵椿蛐蛄小=。最水平也持续增高,与未用药组相比差异显著。赴靡┳橄赴1养用药与未用药的细胞、赴R┪镒饔玫∈笔占赴提取细胞总C糠軷标本中均加入少量腞端引入酶切位点。纯化后的锞盖小⒃俅炕螅诟吲ǘ萒补平末端及为思覣尾。再次纯化后,与靥辶印⒅票窤—寺片断的阳性克隆。结果:细胞末用药组鲋柿#琄赴∷细胞未用药组测到;赴∷嵫巫椴獾细胞细胞羟基脲组测到:赴从靡┳椴獾次,细胞羟另外橄赴獾内对照序列。经与魍葱员冉希渲械个新源基因位点的上下游个碱基分别加下上游个碱基组成两种可能的;测到;
终发现,形成的二级结构不符合募ū曜迹床皇堑湫偷姆⒓现完全匹配的同源基因,在菘庵幸参凑业叫蛄邢嘟囊炎⒉结论:经过严格的分离微小僮鞴蹋钪盏玫个微小但经基因同源性比较、疤宥督峁乖げ獾龋枰耘懦猰。此结果的出现说明:贙赴癏细胞向红细胞系分化过程中,在药物诱导此两株细胞珠蛋白基因表达过程中,可能没有斡牖因调节;捎诖朔掷敕椒ㄊ躮表达水平的限制,不排除上述细灵敏度的分离方法出现后才能再次验证结论。关键词:血红蛋白基因调节微小状结构,排除了它们是目赡苄浴A砣鲈贕则没有发室膊环蟤的鉴定标准。由于内对照成功克隆、测序,可以排除阴性结果是由人为操作失误造成。胞可能存在极低水平的鹘谝蜃印W钪栈褂写碌母行А⒏
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