HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择.ppt

HPLC HPLC 分离条件的优化步骤以及定分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择量计算公式的选择分离条件的优化定量计算公式的选择 HPLC 分离优化基本概念主要内容确定分离模式与色谱柱 1. 1. HPLC HPLC 分离优化基本概念分离优化基本概念一、分离度与基本色谱分离方程式 1、分离度——柱的总分离效能指标柱效参数: 标准偏差(?): 倍峰高处色谱峰宽度的一半半峰宽(W1/2): 色谱峰高一半处的宽度 W1/2 = ?峰底宽(W) :W=4 ? 1. 1. HPLC HPLC 分离优化基本概念分离优化基本概念 21 )1()2()(2W W ttR R R???R= ,色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开; R= ,表明两个相邻组分只有 94% 分离开。(最低指标) 分离度表达式: R=n 1/2 /4?(α-1)/ α?k 2′ /(1+k 2′ ) R受热力学因素[容量因子 k ′和选择性系数α(α= k 2′ / k 1′)]和动力学因素(理论塔板数 n)两个方面控制。若相邻两峰的峰底宽近似相等,令W2=W1= W,引入相对保留值和塔板数, 分离度公式演变为下式: 柱效项柱效项柱选择项柱选择项柱容量项柱容量项 1. 1. HPLC HPLC 分离优化基本概念分离优化基本概念 2、色谱分离基本方程式 、分离模式的选择 2. 色谱柱的选择 2. C18/C8 :以 15cm为佳,可解决 80%的样品分析,柱效应大于 50000 。特殊样品用特定的柱子不同柱子其保留性差异很大,相同条件,不同柱子比例会不一样。不同色谱柱需合适的 pH范围,一般在 - 之间,有的色谱柱比较耐碱, kromasil 可以到 10 ,而杂化 xterra 在1-12, XDB 在pH3-11. 容量因子和死时间的测量在 HPLC 分析中,容量因子 k′是一个非常重要的参数,对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。 k ′=t ′ R/ t M t ′ R = t R - t M在 HPLC 分析中,死时间表示了一个在高效液相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间。 3. t M = L πr 2 ε T / F 式中, L为柱长, cm ;r为柱内径半径, cm ;F为流动相体积流速, cm 3 /s;ε T 为总孔率,对全多孔固定相为 ,对化学键和固定相、离子交换剂为 ,对薄壳型固定相为 。死时间 t M的测量比较困难,有以下几种方法: 3. t M =Φη L 2/△ pd p 2式中, Φ为阻抗因子; η为流动相的动力黏度; L 为柱长; △p为柱压力降; d p为固定相粒径 c /d p≥ 10 时,可按下述公式计算 t M: t M =L / u 对全多孔固定相 u= c 2 对非多孔固定相 u=3F/d c 2 3.