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简答题: 1. 基因工程的基本过程:①获取目的基因②重组体的制备③重组体的转换④重组体筛选和鉴定⑤外源基因在宿主细胞中的表达 2. 基因工程的基本原理:①提高外源基因的剂量—分子遗传学原理②筛选修饰重组基因表达的转录调控元件,如启动子、增强子等—分子生物学原理③修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件-分子生物学原理④基因工程菌(微型生物反应器)的增殖及稳定生产-生化工程学原理。 3. DNA 重组载体的功能:①为外源基因提供进入受体细胞的转移能力②为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力③为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力 4. DNA 重组载体所具备的的条件:①具有对受体细胞的可转移性或亲和性,以提高载体导入受体细胞的效率②具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,使得外源基因在受体细胞中稳定遗传③具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,有利于外源基因的剪接插入。 、用途及区别:①克隆质粒:常用于克隆和扩增外源基因②测序质粒:通常高拷贝复制,含有多酶切口的街头片段,便于各种 DNA 片段的克隆与扩增③整合质粒:含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列,克隆在这种质粒上的外源基因进入细胞后,能准确地重组整合在受体细胞染色体 DNA 的特定位点上。④穿梭质粒:含有两个亲缘关系不用的复制子结构以及相应的选择性标记基因,能在两种不同种属的受体细胞中复制检测⑤探针质粒:被设计用来筛选克隆基因的表达调控条件⑥表达质粒:使克隆在合适位点上的任何外援基因均能在受体细胞中高效表达 C os 质粒区别:黏粒重组分子进入受体细胞后,依靠质粒 DNA 部分的复制子结构进行自主复制,其拷贝数取决于质粒本身的性质,而且由于重组分子失去了体内包装的能力,故其分离纯化只能采用质粒的方法。 4-DNA 连接酶的生物活性:①修复双链 DNA 上的单链缺口②连接 RNA-DNA 杂交双链上的 DNA 链缺口或 RNA 链缺口③连接完全断开的两个平头双链 DNA 分子。 8. T4-DN A 的修饰性活性:①5’→3’的DNA聚合活性②3’→5’的核酸外切酶活性③无5’→ 3’的核酸外切酶活性。Ⅰ类酶Ⅱ类酶(最常用于 DNA 重组) Ⅲ类酶酶分子三亚基双功能酶内切酶和***化酶不在一起三亚基双功能酶识别位点二分非对称序列 4-6bp 短序列,大多数为回文结构 5-7bp 非对称序列切割位点距离识别位点至少 1000bp ,无特异性在识别位点中或靠近识别位点在识别位点下游 24-26bp 处限制反应与***化反应互斥分开的反应同时竞争限制作用是否需要 ATP 需要不需要需要 9. Klenow 酶的生物活性:①5’→3’的DNA 聚合活性,使DNA 链在模板的指导下延伸②3’→5’的核酸外切酶活性,其主要功能是识别并切除错配的碱基,保证 DNA 复制的准确性③无5’→ 3’的核酸外切酶活性④无核酸内切酶活性 10. Klenow 酶的副反应即催化活性:①修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端②以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA 片段进行标记③用于催化 cDNA 第二链的合成④用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列 11. 受体细胞的类型及其特点:①限制缺陷型:打破细菌转化的种属特异性,提高任何来源的 DNA 分子的转