“细胞培养技术实用篇”.ppt

Excellent handout training template
细胞培养技术实用篇
细胞生物学技术
第三章 细胞培养基本技术
王 云
心速度过大、时间过长;会造成细胞损伤和死亡。
密度梯度离心法： 用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中;再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400;Percoll;泛影葡***等。
胰蛋白酶Trypsin
对细胞间的蛋白质水解;使细胞离散。
消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关。
适于消化细胞间质较少的软组织;能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织;如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效。但若与胶原酶合用能增加其对组织的分离作用 。
钙镁离子和血清抑制其活性。
常用剂量为0。25%;PH8;温度37℃
胶原酶法collagenase
水解结缔组织中胶原蛋白成分;对上皮细胞影响不大。
产品有Ⅳ Ⅶ Ⅸ等型;分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞及纤维组织。
钙镁离子和血清不影响活性;PH6。5-7
常用剂量为200U/ml
EDTA法
EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合物;利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。
缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状;有团块;常不单独使用;可与胰蛋白酶混合使用1：1或2：1;既利于细胞脱壁又利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。
EDTA工作液的浓度为0。02％;用不含钙、镁PBS配制。
二、原代培养primary culture
从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养;即将动物机体的各种组织从机体中取出;经各种酶常用胰蛋白酶、螯合剂常用EDTA或机械方法处理;分散成单细胞;置合适的培养基中培养;使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
原代培养细胞
组织和细胞刚刚离体;生物学特性未发生很大变化;仍具有二倍体遗传性;最接近和反映体内生长特性;是药物测试、细胞分化等实验的很好对象；
原代细胞培养也是建立各种细胞系cell line或细胞株cell strain必须经过的阶段。
原代细胞培养多由各种细胞成分组成;比较复杂;即使是经过处理后的细胞;也仍具有异质性heterogeneous;主要表现在细胞形态和大小不一
原代培养的方法
悬浮细胞培养法
器官培养法
组织块培养法
细胞培养法
悬浮细胞培养法
对于悬浮生长的细胞。如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无须消化;可采用低速离心分离;直接培养。
器官培养organ culture
指组织、器官原基;以至整个器官或其一部分在体外的维持或生长;它们可以分化与保持原来的结构与功能。
细胞培养法方法与步骤
1 动物处死：将出生2～3d乳鼠;
用脱颈方法处死。用酒精棉球
擦拭解剖部位。
2 取材及剪切：在无菌条件下将
组织取出;置于无菌培养皿中;
剪去多余的组织脂肪等;
用PBS液洗涤1-2次；放入另一
培养皿中;将组织剪成1mm3大
小的块。
细胞培养法方法与步骤
3 消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌试管内;加入5～6倍量的0。25％胰蛋白酶液pH7。4 ～ 7。6;置37℃水浴中消化20 ～ 40min;每隔10min摇动一次;直到组织块变得疏松;粘稠;且颜色略变为白色为止。取出试管;加入5ml培养液;用吸管反复吹打组织块;使其分散成细胞悬液;将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。
细胞培养法方法与步骤
4计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上;按白细胞计数法进行计数；计数后用培养液稀释;稀释后的浓度一般以每毫升含3 ～5×105个细胞为宜。
5分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶 or 培养皿中;盖好;做好标记;置于37℃ CO2培养箱中培养。
6观察：逐日检查培养物是否污染;观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时;即可进行传代培养。
细胞培养法注意事项
取材的组织最好尽快培养;若不能及时培养;可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大;应先将其切成1cm2以下的小块再低温保存;但时间不能超过24小时;因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡；
取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、***等。
3。 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。修剪和切碎过程中;为避免组织干燥;