碱性磷酸酶的分离纯化.ppt

碱性磷酸酶(AKP)的分离纯化
生物化学与分子生物学系 袁野
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实验目的:
从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的生成量来确定。
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磷酸苯二钠
磷酸盐 +
酚
AKP
酚 + 4-氨基安替比林
红色醌类衍生物
铁***化钾
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管号 空白 标准 A B C D
酶液体
酚标准液
Tris-Mg(AC)2
复合底物
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
2. 加入底物后, 立即混匀, 37 ℃ 准确15 %铁*** ml终止反应, 混匀, 静置15 min , 510 nm比色（大比色杯）
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AKP纯化程度鉴定
AKP纯化程度用酶的比活性反映。
酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
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BCA法测定AKP蛋白浓度
BCA (bicinchoninic acid, 二喹啉甲酸)
Protein + Cu2+
OH-
Cu+
BCA 试剂
紫色复合物
(三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定
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管号 空白 标准 A B C D
酶液体
蛋白标准液
Tris-Mg(AC)2
BCA试剂
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
2. 混匀后37℃水浴30min, 562nm比色（小比色杯）
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管号 空白 标准 A B C D
酶液体
酚标准液
Tris-Mg(AC)2
复合底物
管号 空白 标准 A B C D
酶液体
蛋白标准液
Tris-Mg(AC)2
BCA试剂
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）酶活性测定
2. 取试管6支编号（体积单位为ml）酶蛋白含量测定
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管号 空白 标准 A B C D
酶液体