丹红注射液预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞损伤的影响.doc

丹红注射液预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞损伤的影响
郑亚萍 韩坤 [摘要] 目的 研究丹红注射液预处理对大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的作用。 方法 体外培养大鼠心肌细胞,将丹红注射液以2%、4%、8%、16%四种浓度分别加入培养基花萃取制备而成,具有保护心血管的作用,已有动物实验提示丹红注射液对大鼠离体心脏缺血再灌有保护作用[1],但其对缺血再灌心肌细胞的直接作用的报道较少。本研究采用心肌细胞缺血再灌注细胞模型,观察丹红注射液预处理对其的影响,初步研究其作用的可能机制。
1 仪器与试药
实验动物
出生2~3 d的SD大鼠。
试剂
丹红注射液(济南步长制药有限公司,批号:Z20026866),胰蛋白酶、DMEM培养基(均为Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青公司),鼠抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体、抗Bcl-2、抗Bas(均为博士德公司),其余试剂均为市售分析纯。
心肌细胞培养、鉴定
取2~3 d的SD大鼠,在无菌条件下取出心室,剪碎,%胰酶消化,收集细胞,离心,重悬,置于二氧化碳培养箱中孵育。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间不同, h,获得心肌细胞。免疫组化染色观察α-横纹肌肌动蛋白反应。
缺血再灌注体外模型的建立
将培养的心肌细胞更换无血清培养基,缺氧培养箱(95%N2、5%CO2)中培养3 h后,置10%胎牛血清DMEM培养基,常规培养9 h。
实验分组
将心肌细胞按照2×105/mL均匀的接种于24孔板中,丹红组分别以2%、4%、8%、16%的给药浓度[1],实验共分6组,每组5个孔,即:①正常对照组(用无胎牛血清的高糖DMEM培养液);②缺血再灌注(I/R)组;③I/R+丹红注射液(2%)组;④I/R+丹红注射液(4%)组;⑤I/R+丹红注射液(8%)组;⑥I/R+丹红注射液(16%)组。
流式细胞仪检测凋亡率
%胰蛋白酶消化各组心肌细胞,用4℃预冷的PBS洗涤2次,离心5 min,重悬细胞,于70%冷乙醇(4℃)过夜。检测时离心10 min(1 000 r/min),PBS洗去乙醇。细胞沉淀用碘化丙啶(PI)4℃避光染色30 min,上机检测。G期前的亚二倍体峰即代表凋亡峰,反映凋亡细胞的百分比。
Bas、Bcl-2基因蛋白表达
各组心肌细胞爬片,固定,在室温下用3% H2O2处理30 min以灭活过氧化物酶,后加入Bcl-2、Bax抗体4℃过夜,加入冲洗后依次加入1∶100生物素化山羊抗兔IgG和1∶100抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物液,DAB染色,复染,脱水,透明后封片。细胞浆显示棕黄色颗粒细胞为阳性细胞,将玻片于光学显微镜下放大200倍,根据阳性细胞分布情况,每片选择10个视野,每视野计算Bcl-2、Bax蛋白阳性表达的细胞数,以平均计算阳性细胞数所占百分比作为Bcl-2、Bax蛋白蛋白阳性表达指数。

统计学方法
采用SPSS ,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,多组比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK检验。以P <