实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx

实时荧光定・PCR操作步骤
以下实验步骤仅供参考：
1样品RNA的抽提
取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
***仿盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，
Taq酶1pl
6阳性模板DNA5pl

8总体积50pl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10pl



Taq酶1pl
6待测样品cDNA5pl

8总体积50pl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93工2分钟，然后
93°C1分钟，55°C2分钟，共40个循环。
5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
序号反应物剂量




dNTP混合液3ul
Taq聚合酶1ul
cDNA1ul
加水至总体积为25ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94°C1分钟；55°C1分钟；72°C1分钟）；72°C延伸5分钟。
PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1x1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
体系配置如下：
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul
3下游引物1ul4dNTP1ul
5Taq聚合酶2ul
6待测样品cDNA5ul
ddH2O30ul
总体积50ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93°C2分钟预变性，然后按93°C1分钟，55°C1分钟，72°C1分钟，共40做个循环，最后72C7分钟延伸。
7实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA5OOng,100mg肺提取RNA200ng,脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C15min（反转录反应）
85°C5sec（反转录酶的失活反应）
RealTimePCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA（18SrRNA）做为内参。
基因
引物序列
扩增片段长
度
NR2B
NR2B(+)
CCGCAGCACTATTGAGAACA
213bp
NR2B㈠
ATCCATGTGTAGCCGTAGCC
18s
18s
TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA
198bp
rRNA
rRNA(+)
18s
CGTTTATGGTCGGAACTACGA
rRNA(-)
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂
使用量
终浓度
SYBRPremixExTaqTM(2x)

1x
PCRForwardPrimer(10pM)
1pl

PCRReversePrimer(10pM)
1pl

模板（cDNA溶液）

dH2O
10pl
Total
25pl
全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF,4管做18Sr