植化方法学沈阳药科大学天然药物化学教研室.ppt

植化方法学(一)
天然药物化学教研室
邱 峰
2010年 3月
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植化方法学涉及内容
药材
提取物
单体化合物
结构鉴定
分离
化学及波谱学
提取
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如何开展研究-注意点
查阅程度应停止滴加样品溶液，晾干或低温干燥（注意有毒溶剂的处理）后再继续操作，直到样品溶液全部加入。
2)、装柱：
将拌样硅胶10~20倍量的柱色谱硅胶浸泡于起始溶剂中，搅拌赶出气泡，装入准备好的玻璃柱中，平衡至不再下降为止。
3)、上样：
待硅胶柱平衡好后，将干燥好的拌样硅胶用漏斗加入柱子上部（加入前要保证起始溶剂在柱子中足够的高度以免带入气泡）。
4)、加入保护硅胶或棉花：用起始溶剂洗脱至柱中上端溶剂颜色变浅或无色为止，然后加入适量硅胶或棉花起缓冲作用。
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5)、柱色谱洗脱剂的选择
起始溶剂原则上对被分离样品中的任何物质都没有洗脱能力。洗脱溶剂的选择以硅胶薄层板的色谱行为为先导，~（~）。
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“注”：展开剂和洗脱剂的选择最好参考文献资料。
6)、更换洗脱剂
在一个洗脱剂系统下，一般要求至少洗脱3~5个保留体积，实验中可根据具体情况决定是否更换，比如到5个保留体积还有较大量的的物质被洗脱下来，就应当继续洗脱下去。
7)、保留体积的估算
浸泡硅胶的溶剂量 + 空柱溶剂量–柱床上端溶剂量
=保留体积
8)、流速的提高：柱上端加压或下段流出口减压，特别是填料硅胶粒度小时可采用这两种方式加快洗脱速度。
9)、合并相同流份：硅胶薄层色谱指导合并，流份体积根据硅胶柱大小和分离样品量确定。
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10、硅胶中低压柱色谱及高效液相色谱
1)、流动相的选择：
通过硅胶薄层摸索液相色谱条件，最好用高效薄层指导来选择流动相，其粒度接近于制备色谱柱填料，用自制的硅胶薄层选择流动相时注意粒度和含有水分的影响。另外也可用同类型填料的分析柱摸索流动相条件。
2)、样品溶液的处理：
尽可能选择流动相溶解样品，并用微孔过滤器过滤。选择极性大于流动相的溶剂配制样品溶液会因进样量的不同影响保留时间和分离效果。
3)、检测器的选择：
有紫外吸收的物质尽可能用紫外检测器，无紫外吸收的或紫外吸收较弱的可选用示差 检测器。目前出现的蒸发光散射检测器则是几乎对所有的非挥发性天然化合物适用。
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11、硅胶干柱法（适用于有颜色或荧光的物质分离）
干柱色谱的优点：
1)、分离效果比湿装柱高。
2)、洗脱液的选择可直接套用薄层色谱的最佳分离
条件。
3)、常采用塑料薄膜柱，对有荧光或颜色的物质，
可借助紫外灯分割各色带，避免交叉。
4)、适用于制备性分离。
5)、设备简单，消耗溶剂少，节省时间。
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硅胶干柱法的操作
1)、填充：
将硅胶填料（可用柱色谱硅胶）装入玻璃柱或透明塑料薄膜柱中，注意不要留有空隙。
2)、上样：
将拌样硅胶均匀地加入柱的上端，并在拌样硅胶的上方加入与柱内径相同大小的原形滤纸。
3)、展开：
将制备薄层展开剂条件直接用于干柱色谱上，配好足量的展开剂用分液漏斗滴加入柱中，待展开剂渗透到柱子的下端，即停止滴加。
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4)、分割：
根据色带或荧光带做好标记，然后用弯勺取出各标记带对应的硅胶（玻璃柱），塑料薄膜柱可直接切割。
5)、洗脱：
用合适的溶剂提取色带或荧光带硅胶，也可装入小玻璃柱用溶剂洗脱下来。
“注意点”：
a ：上样量比正常的硅胶柱色谱要少，一般1:100~1:300；
b ：上柱硅胶的粒度越小效果越好，一般常用100~140目的柱色谱硅胶，大的开放柱粒度要大些。
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12、与硅胶相关的反相色谱填料
常用的反相填料有RP-18(ODS)、RP-8和RP-2
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13、反相分离色谱柱操作上的注意点
1)、流动相为含水系统，同样可由相应的TLC确定柱色谱的分离条件，常用的有机溶剂有甲醇、乙***、四氢呋喃。
2)、柱色谱的填料最好以甲醇浸泡上柱，然后用甲醇洗脱2~3个保留体积，再用水置换出甲醇备用。
3)、样品最好用流动相溶解，尽可能避免溶解在有机溶剂的比例大于流动相的溶液中。
4)、对一些酸碱性物质，为了使峰形变锐，有时流动相加入少量的酸或水，或需配成缓冲溶液（普通的反相色谱柱可耐受的pH为2~9），实验完毕冲洗柱子时一定要先用水，然后用醇。
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常见高效液相色谱柱的