X基因可影响细菌毒力基因表达.doc

1 肺炎链球 X 基因可影响细菌毒力基因表达作者:张雪梅,尹一兵,孟江萍,许颂霄,王虹,黄远帅【摘要】目的: X 与其毒力表达的关系. 方法: 采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株, 通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化,并应用 RT 拟 PCR 测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶( phd ) ,分泌型 IgA 结合蛋白( sIgA ) ,肺炎链球菌自溶酶( lytA ) ,肺炎链球菌神经氨酸酶 A( nanA ) 和肺炎链球菌溶血素( ply ) 在细菌感受态发生过程中的表达, 并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同. 结果: 野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子( CSP )诱导表达增加; X 基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异,但其 ply E 基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达. 结论: comX 可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达. 【关键词】链球菌,肺炎;自转化,细菌;毒力基因 2 0 引言肺炎链球菌是目前发现转化效率最高的一种细菌, 一些可被感受态刺激蛋白( CSP )诱导表达的蛋白基因变异时, 肺炎链球菌的毒力减弱[ 1-2 ]. 我们已发现调控肺炎链 E 基因缺陷后,其毒力会减弱[3]. X 与肺炎链球菌转化相关, 其编码的蛋白具有δ因子的作用,可诱导一系列转化相关的晚期基因如 cinA 拟 recA, cilABCDE, coiA 和 cfl 等的表达,使细菌发生转化[ 4-5 ]. 我们拟通过构建相关基因的缺陷菌株, 比较其与野生菌株的毒力因子表达,X 材料和方法 材料试验菌株及动物 2 型光滑型(SⅡ型) 肺炎链球菌: 中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供,主要遗传特征经鉴定合格. 健康 BALB/c 小鼠 38只, 由第三军医大学动物中心提供. 体质量 18~22 g, 随机分为三 3 组, 野生菌株组( wt, n=12 ), comE 基因缺陷菌株组( comE- , n=13 )X 全基因缺陷菌株组(n=13). 主要试剂 C+Y 半合成培养基:含5 g/L Yeas t 抽提物( Lacks and Hotchkiss,1960 ). 肺炎链球菌 CP1250 的染色体 DNA (含有链霉素抗性基因 str) 、肺炎链球菌 CPM17 的染色体 DNA( 含有标志基因红霉素抗性基因 erm E 断裂基因) 、肺炎链球菌 CPM10 的染色体 DNA( 含有标志基因红霉素抗性基因 X 1断裂基因和标志基因四环素抗性基因 X2 断裂基因),CSP , 由美国 Morrison 教授提供. 引物序列由上海生物工程技术有限公司合成(表 1) ,毒力因子序列由日本遗传子研究所设计并合成(表 2). 表1 扩增各基因的引物序列(略) 表2 毒力基因所用的引物(略) 注: phd 为透明质酸酶,sIg A 为分泌型 IgA 结合蛋白,lyt A 为肺炎球菌自溶酶,nanA 为肺炎球菌神经氨酸酶 A, ply 为肺炎球菌溶血素. 方法 4 . 1 肺炎链球 E, comX1, comX X 全基因缺陷菌株的制备以菌株 CPM17 的染色体 DNA 为模板, PC R E 断裂基因( comEup 拟 erm Edw )片段,以菌株 CPM10 的染色体 DNA 为模板, PCR X1 断裂基因( comX1up 拟 erm X1dw ) X2 断裂基因( comX2up 拟 X2dw ) 片段[4], 胶回收纯化后储于-20 ℃备用. 将肺炎链球菌培养于 CTM 培养基( C+Y 培养基、 1 mmol/L 的 CaCl2 和2 g/L 牛血清白蛋白) 中至 A550 nm=0. 1 左右,加入感受态刺激因子( CSP ) 20μ g/L ,然后分别加 E, comX1, comX2 断裂基因的 PCR 产物各 1 g/L 于不同的试管中, 37℃孵育 90 min ,然后分别铺于含红霉素( mg/L ), 四环素( mg/L )和二者都含的血平板( TSA ) 上,于 37℃孵箱培养 24~ 48h ,挑取菌落于 C+Y 培养基中培养, 当细菌密度为 A620 nm= 左右时, 冻于-70 ℃冰箱保存,此即为转化菌落. , comX1, comX2 X 全基因缺陷菌株的鉴定将野生菌与缺陷菌同时做转化实验,选用 CP1250 的 DNA 为外源基因; 提取野生菌与缺陷菌的染色体 DNA , 分别以 erm 和 tet 的引物[ 5 ]进行 PCR 扩增. 5 小鼠腹腔感染毒力试验[ 6 ]将过夜培养于 C+ Y 培养基中的肺炎链球菌稀释