双酶切连接全攻略.docx

双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重 组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个 人经验。
1、 回收PCR产物：在进行PCR扩增%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够 了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。
昨天14个测序结果出来，全部是阳性克隆。两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。 回顾自己的实验现补充几点。
就上面的对照简要说一下我的结果。转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆， 约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行 PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接 用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。
下面简要的说一下对照的结果。
A只长出了 3个克隆，以100的基数计算，约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了 单酶切
B约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%
C长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。
D长了很多克隆，证明感受态没有问题。
这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。
JM108感受态细胞的制备
刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了 10支。后来干脆自己做，感觉 质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。
前期工作
分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓'磨刀不误砍材功’。 注意事项
不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从一70r或-20°C甘油保存的菌种划板
（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划S行。同时记得设 立对照：A、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，实验室很多材料从 师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP 阴性空白培基。系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑 克隆。
质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率 与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化 效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50pl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5%。不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体 系25微升）会全量加到200微升的感受态里，约为150ng （， 微克）。效果也好。
试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的（.）,并用超纯水配制,最 好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的，好像是陇西化学制剂， 分析纯。
防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管, tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不 必要的麻烦。
培养基的配制
配制LB-