重叠PCR(Overlap汇总.pptx

重叠PCR (Overlap PCR)的基本原理
及其简单运用
刘梦鸽
谢志能
曹志秦
朱建勋
林福龙

重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。
简介
特点:
可简单迅速将两个DN***段连在一起,用于嵌合体基因的构建。
可以进行定点突变。
可以在两基因片段间加入其他序列——酶切位点或者标签。
丰富的PCR的扩增范围,尤其在获得长DN***段方面,省去常规克隆的繁琐。
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目的基因
5,
5,
3,
3,
解旋、退火
延伸
第二轮扩增
大量目的基因
多次次扩增
PCR图解
运用
通过酶切法得到相应的粘性末端,再利用连接酶得到
任务:两个基因片段,或者一个基因和启动子、终止子要连接在一起。
常用的方法

,使用少
重叠PCR技术
迅速、经济、简单易行
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不可行
几个主要的运用
大于10000bp的基因
基因A
基因B
基因A+B
目的基因
CDS1
CDS2
CDS3
内含子
内含子
无内含子的编码序列
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引物的设计
基因1
基因2
F1 引物
R2引物
R1引物
F2 引物
基因1
基因2
基因1
基因2
碱基相同区域,至少20bp
基因1
基因2
PCR怎么样发生反应?
PCR扩增
PCR扩增
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反应机理
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
加入酶,buffer等反应液。PCR仪中解链,退火——单链模板结合
F1 引物
R1引物
F2 引物
R2 引物
无目标产物
5’
5’
3’
3’
加入F1引物、R2引物
5’
5’
3’
3’
F1 引物
R2 引物
大量扩增目的基因
基因A
基因B
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在定点突变方面的应用
G C …… A A A G G C A T C G A
C G …… T T T C C G T A G C T
F1引物
F2引物
R1引物
R2引物
碱基同源区域
突变碱基
突变碱基:可以在引物上换成任何其他碱基。
碱基同源区域:保证20bp左右,这样有利于Overlap PCR 得到目标序列。
G C …… A A A
C G …… T T T
G C …… A A A T G C A T C G A
C G …… T T T A C G T A G C T
F1引物
R1引物
F2引物
R2引物
G C …… A A A T G C A T C G A
C G …… T T T A C G T A G C T
Overlap PCR
得到突变后的目的基因
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上述反应体系中,反应液的加入有两种不同的方式
一种是先加入酶,模板(基因A和B)buffer,dNTP,水。经过5个循环得到完整的目的基因。然后入引物,大量扩增目的基因。虽然这样操作繁琐,但是可以得到特异性扩增产物。
另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时,但是会出现非特异扩增条带,影响胶回收,产量也会减少。
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注意事项
1、两基因模板间的重叠部分不能少于20bp,否则退火时模板贴不紧,得不到融合的目的基因。
2、四条引物的TM值尽量保持相同或一致,利于引物的灵活使用。
3、控制重叠PCR的循环次数比一般PCR少,这样可以减少非特异性条带。
4、控制PCR模板的浓度,已经融合模板的比例。一般控制摩尔浓度比为1:1,且质量在20ng左右。
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