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实验九--十植物过氧化物酶同工酶 的测定(凝胶圆盘电泳法)
生物化学实验之--
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
1. 学****聚丙烯酰***凝胶电泳原理;
2. 掌握聚丙烯酰***凝胶盘状电泳的操作技术;
3. 学****过氧化物酶同工酶的检测方法。
【实验原理】
以聚丙烯酰***为支持介质的电泳称为聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE)。
聚丙烯酰***凝胶由丙烯酰***(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰***(Bis)在催化剂作用下聚合而成,具有三维网状结构,其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。
聚丙烯酰***凝胶结构
PAGE电泳兼有电荷效应和分子筛效应。由于被分离物质所载电荷数量、分子大小和形状的差异,因此在电泳时产生不同的永动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色,这样就可以在凝胶中展现出酶谱。
为了提高聚丙烯酰***凝胶电泳的分辨率,通常采用不连续聚丙烯酰***凝胶系统,即在分离胶上面加一层浓缩胶,因浓缩胶和分离胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同,电泳开始后,由于浓缩效应,较厚的样品层可以被浓缩的很薄,使电泳具有良好的分辨率。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物。因此,将经过电泳后的凝胶置于H2O2-联苯***溶液中染色,出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置,多条有色带即构成过氧化物酶同工酶的酶谱。
【器材与试剂】
(一)材料小麦芽
(二)仪器设备
稳流稳压电泳仪、冷冻离心机及离心管、
成套电泳槽(圆盘型),pH试纸,其他常规用具
(三) 试剂
1、分离胶缓冲液(pH ) 2、分离胶贮液
3、过硫酸铵溶液 4、浓缩胶缓冲液
5、浓缩胶贮备液 6、电极缓冲液
7、四***乙二***(TEMED) 8、%溴酚蓝溶液
9、联苯***染色母液
【实验步骤】
(一)过氧化物酶的提取:取8~12粒发芽的麦粒,加入1ml H2O Tris- HCl缓冲液(pH ),冰浴上研成匀浆。转入离心管,再用2ml上述溶液冲洗研钵壁并全部转入离心管,4000r/min离心10 min,上清液供电泳分析用。
(二)凝胶的制备
:
(1)将一空心橡皮塞套在距玻璃管上端2cm处。
(2)用封口膜封住玻璃管下端至不漏液体。