基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒.doc

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测,筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。
二、引物
NIC引物
引物名称
碱基组成
目的片段大小
备注
FluA
FluA-M-F30
GAGGTCGAAACG
235bp
甲型流感病毒M基因通用检测引物
FluA-M-R264
ACAAAGCGTCTACGCTGCAG
H1HA
H1 F1147
AT
527bp
H1N1亚型检测通用引物
H1 R1673
AG
HuH1HA
H1HA F768
ACTACTGGACTCTGCTGGAAC
327bp
人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物
H1HA R1094
SWH1HA-1
SW-H1 F786
AATAACATTAGAAGCAACTGG
153bp
此次甲型H1N1亚型流感病毒引物
SW-H1 R920
RnaseP
RnaseP F
AGA TTT T GCG AGC G
约80bp
与real-time PCR中RnaseP引物一致
RnaseP R
GAG CGG CTG A CAA GT
三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit (catalog #74104)
2、β-巯基乙醇(SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115)
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit:QIAGEN One step RT-PCR Kit(catalog #210212)
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega catalog #N2111)
6、检测引物
7、Axygen ,货号:MCT-150-C
8、Axygen PCR管,货号:PCR-02-C
9、Axygen 10μL,100μL,200μL,1000μL带滤芯枪头
10、10μL,100μL,200μL,1000μL加样器
11、可调转速14K离心机:
12、旋涡混合器:
13、生物安全柜:二级生物安全柜
14、PCR仪:
15、琼脂糖:Biowest Agarose Distributed by Gene Tech(pany Limited Lot No. 101685
16、核酸染料:
17、电泳液:5×TBE电泳缓冲液 cat No. 、电泳仪
四、实验步骤
(一)RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液:从Kit中取出RLT液,,每管500μL(在体系配制区操作)。
2、在生物安全柜内将采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)取100μL加入RLT液管中,充分混匀。
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇,混匀后依次加入600μL 70%的乙醇,充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管,打开包装将其做好标记。取步骤(3)中的混合液600μL加入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上,将步骤(3)剩余的混合液全部吸入滤柱中,