谷氨酰胺转氨酶.ppt

工作总结 /述职报告/季度汇报 /演讲报告
谷氨酰***转氨酶
2018. 06. 02
目录
第一、介绍
第二、分离与纯化
第三、理化性质的研究
第四、应用前景
第一、介绍
谷氨酰***转氨酶( Transglutam工作总结 /述职报告/季度汇报 /演讲报告
谷氨酰***转氨酶
2018. 06. 02
目录
第一、介绍
第二、分离与纯化
第三、理化性质的研究
第四、应用前景
第一、介绍
谷氨酰***转氨酶( Transglutaminase，EC2． 3． 2．13，简称TGase) 是一种催化酰基转移反应的转移酶。它具有多种催化功能，能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰***基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构和功能特性。
因此，TGase 在食品、生物医药、组织工程、纺织和皮革工业中都有着广泛的应用前景。
第二、分离与纯化
主要仪器和试剂
J2-MC 微控高速冷冻离心机；ImageMaster VDS 胶成像分析系统；冷冻干燥机。
N-CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸γ-单羟肟酸、还原型
谷胱甘肽、羟***。
香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇等。
谷氨酰***转氨酶活测定方法
Grossowicz 比色法测定酶活力， 以Nα-CBZ-Gln-Gly 和羟***为作用底物， 以L-谷氨酸-γ-单羟肟酸作标准曲线。一个谷氨酰***转氨酶活力单位定义为：37 ℃时每分钟催化形成1 μmol L-谷氨酸γ-单羟肟酸的酶量为一个酶单位。
从标准曲线求出酶活：
酶活力/（U /mL）= 5×A525×稀释倍数/10
提取
经过初步试验，确定食用菌中的谷氨酰***转氨酶是一种胞外酶。从新鲜香菇子实体中提取谷氨酰***转氨酶粗酶的工艺流程为：
分别测定香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇的谷氨酰***转氨酶粗提液的谷氨酰***转氨酶酶活性，、、、 U/mL。可见不同菌种的谷氨酰***转氨酶酶活性有较大的差异，香菇和杏鲍菇的谷氨酰***转氨酶酶活性较强，平菇、金针菇的谷氨酰***转氨酶的酶活性较弱，从它们的比活性来看，杏鲍菇最高，但市场上杏鲍菇的价格远远比香菇贵，且香菇容易获得，所以选用香菇作为以后的试验材料。
超滤方法
采用WB-3 型的中空纤维膜， 截留分子量为30 000 u，在加冰冷却的条件下，，对粗酶滤液进行超滤循环，直到达到相应的浓缩倍数，收集浓缩液。
乙醇沉淀
取粗提取液100 mL，按V（提取液）∶V（乙醇）=1∶1；V（提取液）∶V （乙醇）=1∶；V（提取液）∶V（乙醇）=1∶2体积分数比分别加入经预冷至0 ℃的95 ％乙醇，迅速搅拌，将混和液离心（3 ℃，10 000 r/min，10 min）， mol/L Tris-HCl 缓冲液（）溶解，再次以相同的条件离心，取上清液定容于100 mL，测定酶活，计算酶活收率。
（酶活收率分别为40 ％、38．7 ％、40．8 ％）
***沉淀法
实验方法与乙醇相同。
（ ％）
从图3 可见，香菇谷氨酰***转氨酶粗酶在50 ℃以下保持其稳定性，高于50 ℃时酶的稳定性变差，活性丧失较快。这是因为酶在稳定升高到一定限度时，就会发生高级结构的变化失去部分催化活性， 酶发生的肽链伸展随稳定不同而有不同的伸展速度，温度越高，肽链伸展加深，直至变性，完全失去活性。
由图4 可见，香菇谷氨酰***。
从图5 可看出，~ 左右稳定性最好。
结果如表2 所示，离子强度对酶活的影响不大
由图6 可知，在一定浓度范围内，随着底物浓度的增加，酶促反应速度显著加快， g/L时反应速度不再显著增加，酶促反应速率接近Vmax。
做Lineweaver-Burk 图（图7），根据测定结果得到米氏方程1/V=×1/[S]+，Vmax= g/（L·min），米氏常数Km= g/L。
从图8 可以看出， 纯酶的相对酶活－温度曲线与粗酶大致相同，最适温度也在40 ℃左右，但在30 ℃～50 ℃的范围内都具有较高的酶活性。
结论
香菇谷氨酰***转氨酶粗酶和纯酶酶学性质研究结果显示：香菇谷氨酰***转氨酶粗