P2X7受体介导的HEK293细胞活化与凋亡机理探究.pdf

第二军医大学
博士学位论文
P2X7受体介导的HEK293细胞活化与凋亡机理研究
姓名:吕军
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:焦炳华
20060501
学位论文作者签名:易湃导师警移学位论文作者签名:易辫签字日期:少名年露嘣签字日期:∥形年歹月卯日独创性声明学位论文使用授权书声明保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,有权入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。C艿难宦畚脑诮饷芎笫视帽臼谌ㄊ签字日期:白昝鲁任。
英文缩略词叫/猼渤缩写词英文名称中文名称閜腺苷三磷酸氧化三磷酸腺昔籵·.苯甲酰三磷酸腺昔嘌呤受体小胶质细胞系增强的绿色荧光蛋白砻嬖銮考す饨馕隼子化飞行时间质谱曲猰勰第二军医大学博士学位论文·廿叮
中文摘要嘌呤受体分为和两大类。受体主要由腺苷せ睿琍芴主要由燃せ睢芴逯饕S址治狿和受体家族是一类对钾、钠和钙可通透的离子通道,,与磷脂酶募せ詈图〈既姿岬男纬捎泄亍D壳耙芽寺〕。受体特性与其他六个亚型不同;体外电生理实验表明淘荽碳じ檬芴蹇梢鸱茄≡裥孕⊙衾胱铀彩蓖ㄍ福蝗绻锤椿虺中碳じ檬芴寮瓤梢鸱茄≡裥灾誓た椎揽7牛钪盏贾孪赴亡。虽然受体广泛地分布机体各组织器官,以往认为是唯一被证实分布于小胶质细胞的嘌呤受体。目前免役组织化学一般检测不出来,正常条件下免疫组织化学显示出的阳性细胞一般为神经细胞,而且比较浅淡。细胞外可通过芴蹇梢约せ罱褐氏赴T谔迥冢赴釧浓度很低,不足以激活胶质细胞,表达更多的芴濉6赴贏浓度较高,后者是前者的倍,达毫摩尔水平。在某些病理条件下如脑外伤、缺血、炎症等局部细胞受到损伤而释放出大量敖到獠铮窃诰植康呐ǘ群芨撸一嵯蛄近区域扩散,它们将较长时间地刺激损伤区和其邻近区的胶质细胞,这足以激活胶质细胞,并使其芴灞泶锷系鳌P〗褐氏赴せ詈罂煞蚀蟆⒃錾成典型的吞噬细胞,可产生许多生物活性物质如活性氧、一氧化氮、蛋白酶及一些炎性物质对周围细胞产生损害作用:但另一方面又产生转化因子神经生长因子等物质促进神经组织再生及修复。活化的小胶质细胞在脑外伤、缺血、炎症、、多发性硬化病、蛋白病毒病、退行性病变如及喜∫约八ダ系裙讨衅鸷苤匾5淖饔谩尽管上述病理过程均与小胶质细胞活化有关,但小胶质细胞被激活的机制还不太清楚。综合本研究和以往文献资料,参与小胶质细胞的激活和凋亡效应。如果用特异性拮抗剂阻断淖饔茫柚剐〗褐氏赴托切谓褐氏胞激活后所带来的对周围组织细胞的损害作用和胶质疤痕的形成,从而保护脑组织不受进一步的损害或有利神经纤维的再生。第二军医大学博士学位论文
构建了真核表达重组质粒.。在此基础上,转染人胍鵄试验组中,,匝樽橹校龌蛳下调的基因极少,胞外彼贾屡ǘ燃屏啃вC飨浴T谔粞〕龅个本研究首先使用大鼠受体基因舩与基因融合细胞,使用作为筛选剂,在/浓度下,经过单克隆化,建立了稳定表达受体和的细胞细胞株,经胞外碳さ墓δ芊析和免疫组织化学等测试,该细胞株正确表达受体并稳定传代代以上。我们使用上海生物芯片公司的人虮泶锲譪酒..,分析了细胞外簉诓煌ǘ群褪奔涮跫拢ü罨此转染细胞株后所导致的基因表达变异谱并使用:确椒ń辛私徊的验证。差异表达基因筛选标准为鴌或,狿,,除去质控点、不显著表达及无信号等数据点,在个基因显著上调,,,而显著下调的有个:匝樽橹校龌蛳灾上调,而显著下调的有觥>突蛳灾泶锏氖慷裕芴迳戏从沉怂孀胞外ǘ鹊脑龈撸躊芴褰榈迹虮泶镉谢钤镜那魇啤1泶锵灾显著差异系饔胂碌的基因中,基因受ǘ扔跋斓那魇埔嗍置飨浴我们对其中的条基因进行了验证,其中、’、、、、、慕峁胄酒的表达一致。这些基因涉及细胞周期、细胞凋亡、细胞信号转导等方面。其中大部分基因是首次发现与的调节显著相关。在蛋白质组学方面,通过使用阤揪哂惺杷聪嘈灾实腸蛋白质芯片,结合势追治觯⑾窒赴釧在不同浓度下,通过受体活化的转染细胞株所导致的蛋白表达谱有明星的变异,经砑治觯琌几匝樽楣灿霾煌屎杀鹊姆逯.:/试验组共有霾煌屎杀鹊姆逯4硬煌ǘ仁匝樽榈峰值数量而言,随着胞外鸾ピ龈撸琍芴澹疕赴泶锏牡白质数量有明显增多的趋势。,/第二军医大学博士学位论文
/、琽疞./和,三个试验组中,随着胞外呐ǘ仍