肠出血性大肠杆菌O157：H7 TccP蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备和应用分析.pdf

重庆医科大学
硕士学位论文
肠出血性大肠杆菌O157:H7 TccP蛋白表达、纯化及多克隆抗体
的制备和应用研究
姓名:杨琴
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:宋方洲
20070501
英汉缩略语名词对照完全弗氏佐剂二***亚砜大肠杆菌英文缩写英文全称小中文全称集聚性粘附氨苄青霉素碱基牛血清白蛋白碳酸盐缓冲液柱体积道尔顿弥散性粘附二氨基联苯***双蒸水培养基脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷三磷酸二硫苏糖醇溴乙啶乙二***。’痵譪
丘舐异丙基;肴樘擒羟乙基哌嗪乙磺酸***纤维素酶联免疫吸附测定ノ荧光肌动蛋白染色胎牛血清异硫***酸荧光素小时辣根过氧化物酶不完全弗氏佐剂卡拉霉素千道尔顿局灶性粘附培养基分钟光密度邻苯二***聚丙烯酰***凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应聚偏二***乙烯每分钟转速秒十二烷基磺酸钠乙酸乙二***四乙酸缓冲液细胞骨架偶联蛋白℃···重庆医科大学硕士研究生学位论文甤朗.
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起鉴趁鉴重庆医科大学研究生学位论文独创性声明学位论文版权使用授权书论文作者签名:指导教师签名:期:申请学位论文与资料若有不实之处,,即:,,,可以采用影印、,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材科,:日期:
肠出血性大肠杆菌:蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备和应用研究’摘要肠出血性大肠杆菌:是一种重要的传染性病原菌。自年首次被分离以来,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。:感染可致腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征把Kㄐ匝P“寮跎傩宰像等疾病,严重者可导致死亡。的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已成为全球性公共卫生问题。目前对其感染仍缺乏有效的防治方法,研究证明抗生素可促使菌释放致死性志贺***佣够颊卟⒎的危险性增加,因此进一步研究其致病机制以寻找新的有效的防治方法具有重要义。病原体和宿主的相互作用是决定感染及发病的关键。与宿主肠道粘膜上皮细胞的粘附是疾病发展的第一步。介导细菌粘附定植的主要结构单元是Ⅲ型分泌系统。,经一系列的信号传导过程介导与宿主细胞的“粘附与擦拭”/损伤。是最近发现并确定的一种新的:毒力因子,是转移至宿主细胞的效应分子中与宿主细胞分子甒酆现⒌癐兰嗷プ饔玫闹斩诵вΨ肿樱篐重庆医科大学硕士研究生学位论文‘国家自然科学基金资助项目重庆市科委自然科学基金计划资助项目
因组内编号为目7旁亩量蛐蛄斜嗦耄且桓龈缓彼岬牡白,为粘附宿主细胞、形成肌动蛋白踏板、造成疎损伤所必需。本课题采用基因工程的方法对肠出血性大肠杆菌:蛋白进行了克隆表达、纯化,进而在此基础上制备了高滴度和高特异性的兔抗多克隆抗体并对其应用进行了实验研究。首先选择昊蜃槲D0澹捎肞及序列测定等方法获得寺≈猎吮泶镌靥;蟪Ω司鶥,诱导表达;对在┒融合了纯化标签的表达产物进行法分析;使用离子换树脂进行蛋白纯化;纯化蛋白进行狿慷分析。实验结果显示:成功构建了原核表达质粒结果表明,经诱导在大肠杆菌中表达了分子量为左右的目的蛋白;表达产物经离子交换树脂纯化,.融合蛋白纯度为%以上。,成功制备了有较高滴度和特异性的兔抗多克隆抗体。以所获特异性多克隆抗体作为一抗,使用双向免疫扩散、和免疫荧光等方法检测标本中蛋白。结果显示:免疫扩散检测可见兔抗多克隆抗体稀释度为保猿氏置飨猿恋硐撸籈检测结果抗体滴度为籛检测表明:用兔抗多克隆抗体与抗原进行免疫印迹,在分子量约处有一特异性条带,;细胞免疫荧光检测显示,::重庆医科大学硕士研究生学位论文
在被细菌粘附的细胞部位可见绿色荧光,其分布与细菌粘附的部位一致。提示:所制备的兔抗多克隆抗体与粘