右美托咪定对大鼠脊髓CXC...响及对其神经运动功能的作用 张鲜.pdf

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DOI:.1672-
·经验交流·
右美托咪定对大鼠脊髓CXCR4-FAK信号通路的影响
及对其神经运动功能的作用
张鲜
(南阳医学高等专科学校第一附属医院药学部,河南南阳473000)
摘要:目的探究右美托咪定对大鼠脊髓CXC趋化因子受体4-粘着斑激酶(CXCR4-FAK)信号通路的影响及对其神
经运动功能的作用。方法将100只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、实验组及DPA组,各25只,采用开胸夹逼主
动脉弓15min构建脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型,假手术组仅开胸游离主动脉但不做夹逼处理。建模后实验组与DPA组于
µµ
缺血前3d鞘内注射右美托咪定与DiprotinA各30L,浓度均为5mol/L,假手术组及模型组则注射等量生理盐水,各组
均连续干预14d。采用脊髓运动功能(BBB)评分评估大鼠运动功能,TUNEL检测脊髓组织细胞凋亡率;***还原酶法检
测血清NO、eNOS及iNOS含量,蛋白免疫印迹(WB)法检测大鼠脊髓组织CXCR4、p-FAK蛋白表达。结果与假手术
组比较,模型组、实验组及DPA组细胞凋亡数均升高(P<),与模型组比较,实验组、DPA组细胞凋亡数均降低
(P<);与假手术组比较,其他各组大鼠血清NO、eNOS水平均降低,iNOS水平升高(P<);与模型组比较,实验
组、DPA组血清NO、eNOS、iNOS水平均降低(P<),而实验组与DPA组血清NO、eNOS、iNOS水平比较差异无统
计学意义(P>);与假手术组比较,其他各组大鼠脊髓组织CXCR4、p-FAK蛋白表达量升高较明显(P<),与模型
组比较,实验组、DPA组CXCR4、p-FAK蛋白表达量均升高(P<),而实验组与DPA组CXCR4、p-FAK蛋白表达量
比较差异无统计学意义(P>)。结论右美托咪定可通过激活CXCR4-FAK信号通路,抑制脊髓损伤所致的细胞凋亡,
改善受损脊髓组织,促进神经运动功能恢复。
关键词:脊髓缺血再灌注;右美托咪定;CXC趋化因子受体4-粘着斑激酶信号通路;神经运动功能
中图分类号:R-33
中枢神经系统疾病中脊髓损伤较为常见,其1材料与方法
主要原因是由于术中临时阻断胸腹主动脉导致脊

髓缺血,此后血流再恢复很可能会出现更为严重

的损伤,引发神经元凋亡甚至坏死而导致神经功
大鼠,鼠龄11周左右,体重(248±13)g,浙江
能及血脊髓屏障功能等破坏,严重影响患者的健
省实验动物中心提供,动物使用许可证号:SYXK
康和生活质量。右美托咪定具有镇痛、镇静、交
(浙)2008-0032。大鼠取回后能够自主进食进水,
感神经阻滞等作用,是一种高选择性、强效的α2-动物存放室温度及湿度设为25℃及40%左右。动
ARs激动剂,其通过和α2A肾上腺能受体发生反物的使用及实验操作按照《实验动物管理条例》
应而起到神经保护的功能。有研究表明[1],右美规定执行,并依照3R原则给予动物人道主义
托咪定能降低心、脑、肾等组织的炎性反应及氧关怀。
化应激作用,从而降低组织损伤程度,,湖南
功能。CXC趋化因子受体4-粘着斑激酶(CXCR4-科伦制药有限公司,批准文号:国药准字
FAK)是重要的内源性氧化应激信号通路之一,H20183149;CXCR4激动剂DiprotinA,美国cell
能使骨髓间充质干细胞加速迁移至脊髓缺血再灌signal公司,批号:A13074;细胞凋亡原位检测
注损伤组织,使它们的粘附力更强,发挥对大鼠(TUNEL)试剂盒,北京中山生物技术有限公司;
脊髓的保护作用[2]。因此本研究旨在探究右美托BCA试剂盒,碧云天生物技术有限公司;CXCR
咪定对大鼠脊髓CXCR4-FAK信号通路及其神经运抗体、p-FAK抗体,美国Abcam公司产品;4%多
动功能的影响。聚甲醛,北京索莱宝科技有限公司;戊巴比妥钠,
收稿日期:2021-12-30
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上海上药新亚药业有限公司;Westernblot试剂盒,(WB)法[6]检测大鼠脊髓组
美国Abcam公司产品。织CXCR4、p-FAK蛋白表达将各组保存于液
,裂解后离心后获
Thermo公司;微量移液器购自德国Eppendorf公得上清,提取组织总蛋白,经BCA法定量,取
司;超净工作台购自珠海市再鑫仪器有限公司;50g样品,常规进行检测,以甘油醛-3-磷酸脱氢
小型垂直电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限酶(GAPDH)为内参,经系统分析各组CXCR4、
公司产品;光学显微镜购自上海无陌光学仪器有p-FAK表达情况,每个样品进行3次独立重复
限公司;超速离心机购自美国Sigma公司等。操作。


-
为模型组、实验组(即右美托咪定组)、CXCR4-行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,
FAK信号通路激动剂DiprotinA组(DPA组)及多组间比较采用方差分析,两两比较采用t检验,
假手术组,各25只。P<。
[3]及药
2结果
物处理注射麻醉后,常规消毒,采用右侧卧位,
再肋缘行纵切口,于显微镜下逐层分离,
心包处分离胸主动脉,夹逼主动脉弓锁骨上做动与假手术组比较,建模后、药物干预14d后
脉起始点,15min后移除动脉夹,假手术组不做各组大鼠BBB评分均降低,差异有统计学意义
夹逼处理,术后静脉注射氨苄青霉素以防止感染。(P<);药物干预14d后模型组、实验组及
建模成功后每只大鼠行常规饲养。实验组在造模DPA组均显著高于同组建模后,差异有统计学意
前3d鞘内注射30μL盐酸右美托咪定注射液,义(P<);药物干预14d后与模型组比较,实
DPA组在造模前3d鞘内注射30μL激动剂验组、DPA组评分均升高,差异有统计学意义
DiprotinA,浓度均为5μmol/L。假手术组及模型(P<),而实验组与DPA组比较差异无统计学
组则注射等量生理盐水。意义(P>)。见表1。
-Beattie-Bresnahan-
表1各组大鼠神经运动功能比较(n=25,x±s,分)
(BBB)评分评估大鼠神经运动功能[4]分别于建
d
组别建模后药物干预14后t值P值
模后与药物干预14d后各组随机选取15只大鼠,.±..±...
假手术组2124251211724800990921
进行BBB评分并通过体感诱发电位监测评估大鼠.±.).±.)..
模型组613161189717515972<0001
.±.).±.))..
脊髓功能,连续测定3次计算平均值。实验组68916711028196126583<0001
DPA.±.).±.))..
[5]检测大鼠脊髓组织细胞凋亡组67711311072205128437<0001
..
情况取各组大鼠L脊髓节段,制备冰冻切片,F值4**********
4-6..
经脱蜡后,对切片冲洗后,消化15min(置于2%P值<0001<0001
注:1)与假手术组比较,P<;2)与模型组比较,
的蛋白激酶K中),重复冲洗1次,以TUNEL反
P<。
应液缓慢滴加于其中,而后于避光孵育1h(温度
设为37℃),再以PBS冲洗液冲洗2次,
甘油缓冲液(浓度为20%)进行封片。观察凋亡假手术组、模型组、实验组及DPA组大鼠脊
细胞情况,于显微镜下随机对6个不同视野,而髓组织细胞凋亡数分别为(±)%、
后估算凋亡细胞数。凋亡细胞数(%)=凋亡细胞(±)%、(±)%、(±
数/总细胞数×100%。)%,差异有统计学意义(F=,
(NO)、内皮型一P<);与假手术组比较,模型组、实验组及
氧化氮合酶(eNOS)与诱导型一氧化氮合酶DPA组细胞凋亡数均升高,差异有统计学意义
(iNOS)含量于大鼠尾静脉取血,离心后收集(P<);与模型组比较,实验组、DPA组细胞
上清液,其中血清NO、eNOS与iNOS含量以比色凋亡数均降低,差异有统计学意义(P<),实
法检测(以***还原酶法处理血清)。验组与DPA组比较差异无统计学意义(P>)。
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、eNOS与iNOS含量常释放等现象,导致细胞及其组织环境改变,进
比较而使细胞难以维持血液-脊髓屏障的完整性,导致
与假手术组比较,其他各组大鼠血清NO、患者出现神经运动功能障碍[7]。研究证实[8],右
eNOS水平均降低,iNOS水平升高,差异有统计学美托咪定是一种α2肾上腺素能受体激动剂,其不
意义(P<);与模型组比较,实验组、DPA组仅具有强效、高选择性,还有抗焦虑、镇静、抗
血清NO、eNOS、iNOS水平均降低,差异有统计感染、抗凋亡、中枢性抗交感等作用。刘煜鑫
学意义(P<),而实验组与DPA组上述各指标等[9]研究称,右美托咪定科作用于蓝斑突触前神
比较差异无统计学意义(P>)。见表2。经末梢受体,对兴奋性氨基酸、儿茶酚***等的释
放有抑制作用,使神经元凋亡的速度减缓,还可
表2各组大鼠血清NO、eNOS与iNOS含量比较加速细胞外调节蛋白激素酶1及蛋白激素酶2的
-
(n=25,x±s)磷酸化,从而有效保护神经功能。本研究中建模
NO/(µmol/L)eNOS/(u/mL)iNOS/(u/mL)
组别后及药物干预后各组大鼠BBB评分均较假手术组
.±..±..±.
假手术组45363512204150917102显著降低,药物干预后模型组、实验组及DPA组
.±.).±.).±.)
模型组311218411362135119051411
.±.)).±.)).±.))均显著高于建模后各组,而实验组与DPA组间比
实验组2874162121251123**********
DPA.±.)).±.)).±.))
组2985176121243114**********较差异不显著,提示右美托咪定对大鼠脊髓神经
...
F值2831503**********运动功能具有较好的保护作用。
...
P值<0001<0001<0001CXCR4为基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)特
注:1)与假手术组比较,P<;2)与模型组比较,异性受体,作为启动因子,对骨髓源性细胞迁移、
。
<粘附有介导作用,SDF-1α与CXCR4结合,而后诱
、p-FAK蛋白表导异源三聚体G蛋白激活,再通过Gi亚基激活其
达情况比较下游的胞质酪氨酸蛋白酶(FAK),促使其磷酸化
与假手术组比较,其他各组大鼠脊髓组织生成p-FAK;有研究称[10],p-FAK是由SDF-1α/
CXCR4信号级联激活后产生的,它一方面作为蛋
CXCR4、p-FAK蛋白表达量升高较明显,差异有
白支架,能与CXCR4的Gs亚基很好结合,给下
统计学意义(P<);与模型组比较,实验组、
游的Rho激酶等效应分子传递浓度信号,进而诱
DPA组CXCR4、p-FAK蛋白表达量均升高,差异
导SDF-1α对细胞产生趋化作用,另一方面通过活
有统计学意义(P<),而实验组与DPA组
化磷脂酰基醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白酶
CXCR4、p-FAK蛋白表达量比较差异无统计学意
(PI3K/AKt),从而促进胞膜上整合素β1分子表达
义(P>)。见表3。
上调,进而增强细胞与细胞外基质主要成分的粘
表3各组大鼠脊髓组织CXCR4、P-FAK蛋白表达情况附能力,以抵抗异常细胞的凋亡;有研究表明[11],
-
比较(n=25,x±s)AKt磷酸后可对eNOS有激活作用,生成的eNOS
CXCRpFAK会抑制NO合成,对NO含量有调控作用,同时对
组别4蛋白-蛋白
.±..±.
假手术组079018095026蛋白酶和线粒体ATP敏感性钾离子通道进行激活,
.±.).±.)
模型组29209512141031使线粒体功能得到改善,从而抑制细胞凋亡,此
.±.)).±.))
实验组6241471258312612
DPA.±.)).±.))外对正常机体来说,iNOS表达量较少,当受到外
组61213**********
..界刺激或损伤后,其表达量会增多,从而导致NO
F值145343152758
..
P值<0001<0001的大量产生;右美托咪定可减少细胞损伤和衰退,
注:1)与假手术组比较,P<;2)与模型组比较,增加脑源性神经营养因子的产生。细胞凋亡与脑
P<。缺血再灌注损伤密切相关,其导致细胞损伤的机
制与自由基产生过多及钙超载有关,其中Ca2+活
3讨论
化NOS导致NO生成量增多而介导氧化损伤和细
脊髓损伤会导致不同程度的神经元与神经胶胞凋亡。本研究结果中,与假手术组比较,模型
质细胞坏死,其中缺血再灌注损伤为继发性损伤,组、实验组及DPA组细胞凋亡数均升高
会诱导患者出现炎性反应、细胞凋亡、神经肽异(P<),与模型组比较,实验组、DPA组细胞
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凋亡数均降低(P<);与假手术组比较,其他射低氧预处理骨髓间充质干细胞向大鼠脊髓缺血再灌注损伤
各组大鼠血清NO、eNOS水平均降低,iNOS水平组织迁移粘附中的作用[C]//第十二届华东六省一市麻醉学术
:华东地区
升高(P<),与模型组比较,实验组、DPA组
麻醉学协作组,福建省医学会:430-431.
血清NO、eNOS、iNOS水平均降低(P<),而
[4]陈文佳,孙灿林,
实验组与DPA组血清NO、eNOS、iNOS水平比较脊髓P2X4/NLRP3通路的影响[J].江苏医药,2020,46(3):
差异无统计学意义(P>);与假手术组比较,224-228.
其他各组大鼠脊髓组织CXCR4、p-FAK蛋白表达[5]陈海明,杨玲,
量升高较明显(P<),与模型组比较,实验组、缺血再灌注损伤的影响[J].山西医科大学学报,2019,50(5):
533-536.
DPA组CXCR4、p-FAK蛋白表达量均升高
[6]秦燕,-FAK信号通路观察鞘内注射右美托
(),而实验组与DPA组CXCR4、pFAK蛋
<-咪定改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后神经运动功能[J].中国
白表达量比较差异无统计学意义(P>)。可以比较医学杂志,2020,30(4):77-85.
推测右美托咪定可通过激活CXCR4-FAK信号通路[7]KWIECIENJM,DABROWSKIW,MARZEC-KOTARSKAB,et
,M-T7and
作用。Serp-1,reduceearlyinflammationafterspinalcordinjuryintherat
model[J].FoliaNeuropathol,2019,57(1):41-50.
综上所述,右美托咪定可通过激活CXCR4-
[8]SEOMK,HIENLT,PARKMK,-mTORC1
FAK信号通路,抑制脊髓损伤所致的细胞凋亡,signalingactivationisrequiredforneuroplasticeffectsof
改善受损脊髓组织,促进神经运动功能恢复。LY341495inrathippocampalneurons[J].SciRep,2020,10
(1):993.
参考文献
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1101--3、IL-1的表达和血脊髓屏障的影响[J].现
[2]MASS,ZHOUJK,HUANGTJ,,2019,19(11):2013-2018.
stromalcell-derivedfactor-1neuralscaffoldloadedwithBMSCs[11]樊梦莹,陈杨旸,余晖,
promotesneurologicalfunctionrecoveryaftertraumaticbraininjury咪定减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用[J].中华麻醉学
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[3]王丽萍,郭晓明,高贤伟,-FAK信号通路在鞘内注(张咏编辑)
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