温阳化浊通络方对系统性硬化...A Nrp1信号通路的影响 李颖利.pdf

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·1088·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2022Jul3871088~93
◇复方药物药理学◇
温阳化浊通络方对系统性硬化病小鼠
Sema3A/Nrp1信号通路的影响
,,,,
李颖利12,卞博1,刘东娇1,赵晨光1,郝元森1,韩立12,卞华12,郭克磊12
、,河南南阳473004

文献标志码A文章编号1001-1978202207-1088-06
开放科学资源服务标识码OSID
中国图书分类号R-
摘要目的研究温阳化浊通络方WYHZTLF对系统性硬化
病,小鼠信号素,
systemicsclerosisSSc3Asemaphorin3ASe-系统性硬化病,是一种
,,systemicsclerosisSSc
ma3A/神经纤毛蛋白-1neuropilin-1Nrp1信号通路的影响
,以皮肤增厚和纤维化及胃肠道肺心血管等多个
探讨其治疗SSc的作用机制。方法构建SSc小鼠模型分、、、
系统受累为特征的自身免疫性疾病的病因及
-1
为对照组、模型组、温阳化浊通络方低21g·kg、中42g。SSc
,
-1-1发病机制十分复杂目前认为病因与遗传和环境因
·kg、高84g·kg剂量组和Sema3A抑制剂表没食子
,),素有关,发病机制包括血管病变免疫系统功能失
儿茶素没食子酸酯组epigallocatecholgallateEGCG连续灌、
,调纤维化及三者间的相互作用,共同导致了的
胃给药4周对照组和模型组给予生理盐水处理。HE染色观、SSc
[]
察皮肤病理损伤及真皮厚度免疫组织化学法检测皮肤组织发生和发展1。毛细血管和小动脉等微血管的损
,
血管内皮生长因子AvascularendothelialgrowthfactorA伤和内皮细胞的活化导致的血管病变是SSc进程中
[]
表达水平检测皮肤组织2,
VEGFAWesternblotSema3A、Nrp1最早出现的病变。近年研究发现Sema3A/Nrp1
及的表达水平法检测小鼠血清表达,
VEGFAELISASema3A途径的异常调节与血管病变过程密切相关Sema3A/
水平结果与模型组相比,温阳化浊通络方明显缓解了
。SScNrp1轴已成为血管病变相关疾病的治疗靶点。
小鼠的皮肤病变,对真皮厚度有明显的抑制作用,降低了皮肤,
中医药治疗SSc有较好效果药理研究机制以
组织的蛋白表达水平,同时抑制了皮肤组织及血清中[]
VEGFA抗纤维化为主3。本课题组基于肺脾肾-皮毛相
Sema3A/Nrp1信号通路的蛋白表达水平。结论温阳化浊通
关理论指导创立温阳化浊通络方治疗SSc具有较好
络方可能通过抑制信号通路蛋白表达水平,降
Sema3A/Nrp1临床疗效,前期研究发现温阳化浊通络方能够降低
低的表达,改善血管损伤
VEGFASSc。,
SSc患者血浆内皮素-1endothelin-1ET-1、血管性
血友病因子,水平循环
关键词系统性硬化病温阳化浊通络方vonWillebrandfactorvWF、
Sema3ANrp1内皮细胞数量,降低患者甲襞血管管攀形态血
血管病变SSc、
VEGFA
管流态、襻周状态的积分温阳化浊通络方还可抑制
,模型小鼠血清结缔组织生长因子
收稿日期2022-03-25修回日期2022-05-16SScVEGF、con-
基金资助国家自然科学基金面上项目,河,
No8177430082074415nectivetissuegrowthfactorCTGF和ET-1的表达水
南省科技发展计划项目南阳市科技[]
4-6,
No202102310176平。说明温阳化浊通络方具有保护血管改善
攻关项目南阳理工学院博士科研启动基
NoKJGG104甲襞微循环障碍的作用,但其机制还不清楚本研
金项目。
NoNGBJ-2019-17,
),,,,究通过建立小鼠模型观察温阳化浊通络方对
作者简介李颖利1987-女硕士讲师研究方向中医药治疗SSc
,小鼠信号通路的影响,探讨其治
风湿免疫疾病E-******@
韩立),男,博士,副教授,硕士生导师,研究方,
1977-疗SSc的作用机制为SSc的防治提供理论依据。
向中药药理学,通信作者,
E-******@
卞华),男,博士,教授,硕士生导师,研究方向
1973-实验动物级雌性小鼠
中医药治疗风湿免疫疾病,通信作者,
E-mailbiancrown@只,体质量,周龄,购自浙江维通利
~20g7~8
),,,,华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号
郭克磊1989-男博士讲师研究方向中医药治疗
风湿免疫疾病,通信作者,,
E-******@-0001所有动物的饲养及实验操作
中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2022Jul387·1089·
,
均符合实验动物福利及伦理要求。
,,,
%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、脱水HE染色
,
。每组内每
,
%HY-13653购自美国MedChe-张切片随机挑选3个100倍视野进行拍照。应用
,
mExpress温阳化浊通络组方药材黄芪30g、党参15Image-
,
g、桂枝9g、***羊藿12g、积雪草15g、白芥子9g等合适的视野每张切片测量5处皮肤真皮层厚度
购自河南省张仲景大药房温阳化浊通络组方药液,并求出平均值
。μm。

,
30min置于陶瓷中药煎锅内武火煎煮开后煎304%多聚甲醛固定的小鼠皮肤取出进行蜡块包埋、切
,,,,,,
min过滤并收集药液再次加入蒸馏水煎30min合片置载玻片脱蜡至水EDTA进行抗原修复3%
,,
·BSA室温孵育30min滴加VEGFA1∶100一抗
-1,,,
L于-20℃冰箱保存备用。依据人和小鼠每公洗涤加二抗1∶200洗涤后DAB显色封片于显
,
斤体重剂量折算系数计算温阳化浊通络方低、中、微镜下观察拍摄。每组内每张切片随机挑选3个
-1,
高剂量组的给药剂量分别为21、42、84g·kg。200倍视野进行拍照应用Image-
%多聚甲醛固定液分析阳性的累积光密度值IOD以及组织的像素面
,
P0099、苏木精伊红HE染色试剂盒C0105S、积AREA并求出平均光密度值IOD/AREAMean
,
DAB显色试剂盒P0203上海碧云天BCA蛋白测Density。
,
定试剂盒A53226、、Nrp1
,
美国ThermoFisher哺乳动物蛋白抽提试剂盒及VEGFA蛋白表达给药4周后取小鼠背部皮
,,,,
CW0889北京康为世纪GAPDH鼠单抗AC002肤加入哺乳动物蛋白抽提试剂进行组织匀浆冰浴
,,,
武汉爱博泰克Sema3A兔多抗DF8609、VEGFA裂解离心后取上清液BCA蛋白定量试剂盒定量
兔多抗,江苏亲科,鼠单抗,上清中蛋白浓度,取待测蛋白加入上样缓冲
AF5131Nrp1sc-530730μg
,,
美国SantaCruzHRP标记羊抗兔二抗5220-液煮沸10minSDS-PAGE电泳后转至***纤维素
,,,
0336、羊抗鼠二抗074-1806美国KPL小鼠SE-膜5%BSA封闭1h加入Sema3A、Nrp1、VEGFA
,,,
MA3AELISA试剂盒CSB-EL020980MO武汉华美一抗孵育2hTBST洗涤5次加入对应HRP标记
,,,,
生物石蜡切片机CUT6062德国SLEE包埋机兔、鼠二抗孵育2hTBST洗涤5次ECL试剂显影
,,,,
TKY-BMB湖北泰康医疗组织脱水机MTM德后使用凝胶成像分析系统拍照ImageJ软件分析蛋
,,,,
国SLEE倒置显微镜IX71日本OLYMPUS组白条带的灰度值蛋白相对表达量=目的蛋白条带
,
织细胞破碎仪BulletBlenderSTORM美国NextAd-灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。
,,,

,,
蛋白电泳仪Mini-PROTEAN3、凝胶成像系统Gel后半小时麻醉小鼠通过眼眶动脉采血收集血液放
,,,
DocXR+美国Bio-Rad。入不含抗凝剂的试管中4℃静置2~3h以2500r
-1,,
·min离心10min取上层血清按照ELISA试剂
对照组Control、模型组SScmodel、Sema3A抑制盒操作步骤检测各组血清中Sema3A的水平。
,
剂组EGCG、温阳化浊通络方低Lowdose、±s表示用
,,
Mediumdose、
-1,
只。·d样本比较采用单因素方差分析。
-1
其余各组给予200mg·
-1,
·
[]
7,,
SSc模型。Fig1结果显示与对照组比较SSc模型组真皮层可
,,
、汗腺等结构减少血管壁增
-1,,
·d灌胃连续4周Sema3A抑制剂组采厚局部可见成纤维细胞增生炎性细胞浸润与模
-1-1,,
用腹腔皮下注射10mg·kg·3d连续注射4型组比较温阳化浊通络方低、中、高剂量组和抑制
,
周温阳化浊通络方低、中、高剂量组灌胃剂量分别剂组小鼠真皮层炎性细胞浸润减少。如Fig2所示
-1-1,,
为21、42、84g·kg·d连续给药4周。与对照组相比模型组真皮层明显增厚P<
·1090·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2022Jul387
,
与模型组相比EGCG组真皮厚度明显减弱P<
,
、中、高剂量温阳化浊通络方处理后真皮
层厚度均变薄P<。
Fig3ImmunohistochemistryofVEGFAinmouse
Fig1HEstainingofmouseskintissues×100
skintissues×200
,
Fig2EffectofWYHZTLFondermalthicknessx珋±sn=5
Fig4EffectofWYHZTLFonVEGFAprotein
1Control2SScmodel3Lowdose4Mediumdose5Highdose,
expressionlevelsx珋±sn=5
,
6EGCG.△△P<*P<**P<
1Control2SScmodel3Lowdose4Mediumdose5Highdose
model
6EGCG.△P<*P<
免疫组化法检测各组小鼠皮肤组织,
<
蛋白表达如所示,与对照组比较,模型,
Fig3、4SSc通络方低、中、高剂量组血清Sema3A水平均降低
组蛋白表达增加与模型组比较,,
VEGFAP<<
组蛋白表达明显降低,温阳
EGCGVEGFAP<<。
化浊通络方低中高剂量组蛋白表达均降
、、VEGFA3讨论
低,中高剂量组差异具有显著性
、P<。信号素家族蛋白Sema3A及其受体Nrp1在免
检测小鼠皮肤及
、Nrp1疫调节、细胞凋亡、细胞迁移和血管生成等过程中发
蛋白表达结果如所示,与对照组比,
VEGFAFig5挥关键作用以Sema3A/Nrp1为靶点的针对自身免
较,模型组蛋白表达明显增加[]
SScSema3A、VEGF疫性疾病的治疗已成为当今研究的热点8。Se-
,,蛋白表达明显减弱,
P<<<ma3A是分泌性的糖蛋白其发挥功能必须与受体
与模型组相比,温阳化浊通络方低中高剂
、、Nrp1结合才能协同胞内信号转导。Nrp1在脊椎动
,
量组Sema3A、VEGFA蛋白表达均降低差异具有显物中结构高度保守,其主要表达于动脉内皮细胞,
著性,,蛋白表达均增强,
P<<
高剂量组差异具有显著性,组[]
P<-VEGFA结合介导信号传导9。
表达降低,表达显著降低,
ma3AP<
,蛋白表达明显增强
P<<。参与了SSc患者血管系统的重塑。研究发现SSc患
结果如,

,,
Fig6所示与对照组相比SSc模型组血清Sema3A生血管生成机制的调节导致SSc血管生成的紊
中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2022Jul387·1091·
,
Fig5EffectofWYHZTLFonSema3A,NrP1andVEGFAproteinexpressionlevelsx珋±sn=5
,,,
AWesternblotresultsforSema3A、
,,
2SScmodel3Lowdose4Mediumdose5Highdose6EGCG.△P<△△P<*P<**P<
,
表达提示Sema3A/NrP1信号轴可能参与了SSc疾
病进程,这与上述研究结果相一致给与温阳化浊通
,,
络方治疗后Sema3A蛋白下调表达NRP1蛋白上
,
调表达提示温阳化浊通络方可能通过调节Se-
ma3A/NrP1改善SSc血管生成紊乱。然而也有研
究显示Sema3A在SSc患者血清中表达较正常人
,,
低此外血清Sema3A低表达水平与疾病持续时间
[]
及SCL-70抗体阳性负相关12。这与前述文献结果
,,
不一致Sema3A水平在SSc患者中差异表达可能
与分析的患者数量少或患者处于不同的疾病分期等
Fig6MouseserumlevelsofSema3Adetermined原因有关,与本文结果不一致,可能是因为小鼠
,SSc
byELISAx珋±sn=5模型与患者之间的差异造成的,在
SScSema3ASSc
1Control2SScmodel3Lowdose4Mediumdose5Highdose中的表达及作用机制还需大量临床病例数据及实验
,
6EGCG.△△P<*P<**P<
去进一步证实。
[]是调节血管生成的一个重要因子,其通
10,
乱。同时研究发现SSc患者血清和皮肤NrP1VEGF
的表达水平显著降低,并且较低水平的循环与过参与血管新生及血管形成、维护血管正常状态及
NrP1[]
,完整性等生物过程在进程中发挥作用13研
NVC异常的严重程度和指趾端溃疡的存在有关SSc。
究表明,患者真皮和表皮中的表达水平
而血管内皮细胞沉默NrP1基因及用SSc患者血清SScVEGFA
,
处理的血管内皮细胞都能够导致血管生成受损,结显著增加不同疾病阶段的血清中VEGF也显著上
调表达,但病史时间长的患者体内血管数量却是减
果表明NrP1缺陷在SSc血管生成中发挥关键作
[]
11,少的,尤其是小血管的数目,高水平的持续
用。本研究通过建立SSc小鼠模型发现模型小VEGFA
[]
,14
鼠皮肤组织Sema3A蛋白上调表达NRP1蛋白下调刺激可引起血管生成异常及炎症反应的发生。
·1092·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2022Jul387
甲襞微循环的影响[],,
-20.
[],
激酶受体VEGFR-1、VEGFR-
物学功能,但这两者在患者皮肤的内皮细胞中nailfoldmicrocirculationin30patientswithsystemicsclerosis
SSc[],,
[]-20.
均上调表达15同时,与之间存[],,,
。
在竞争性结合,高浓度的可竞争性结
NrP1Sema3A病小鼠体内血管内皮生长因子、结缔组织生长因子与内皮素-1
,水平的影响[]科学技术与工程,,
-9.
[],,,
合,从而抑制血管内皮细胞的黏附,
[]
生16本研究免疫组化及结果显示,TongluoFormulaonVEGF、CTGFandET-1levelsinsystemic
。WBVEGFA[],
,20181815215-9.
在模型小鼠皮肤组织及微血管内上调表达,温[],,,,
-
阳化浊通络方治疗后,下调表达,提示温阳,
VEGFAflammationandvasculopathyinexperimentalsystemicsclerosis
[],,
.
[],

。[],,
综上所述,及途径的异常inimmune-
VEGFASema3A/Nrp1
158-61.
调节与血管病变过程密切相关,温阳化浊通络方[],,

可通过下调表达,上调表达改[]
Sema3A、-
,,,
善SSc血管病变。但血管生成调节过程异常复杂温giogenesis200811131-9.
[],,
阳化浊通络方通过调节血管生成10Olewicz-
Sema3A/Nrp1SSc
的详细机制及其是否还通过调节其它信号通路发挥3Aandneuropilin-1Newmarkersfordysregulationofangiogene-
[],,

治疗的作用是本课题组有待深入研究的方向
SSc。2749.
[],,,

参考文献neuropilin-1asanovelkeyfactorcontributingtoperipheralmicro-
[],,,[]
.
[],,,
,202139AnnRheumDis20167581541-49.
[],,,
Suppl13143--
[],,,[],,
2ManettiMGuiducciSIbba-
thelossofcapillariesinsystemicsclerosisAngiogenesisversus101625-30.
[],[],,,
,2010146a1241-
[],,[],

鼠及的影响[],,
Wnt2、Wnt3aβ--51.
,[],,,
202137101474-
[],,
-vascularendothelialgrowthfactoranditsreceptorsleadstoinsuffi-
,[]
parisspinosaonWnt2Wnt3aandβ-
[],,,
,202137101474--16.
[],[],,,
-3A
[],[],,
,200927666-
[],
-65.
[][],,
--
,
ChinMed,200927666-
[],[],,
.
EffectofWenyangHuazhuoTongluoformulaonSema3A/Nrp1
signalingpathwayinsystemicsclerosismousemodel
,
12,1,1,1,
LIYing-liBIANBoLIUDong-jiaoZHAOChen-guang
,,,
1,12,12,12
HAOYuan-senHANLiBIANHuaGUOKe-lei
,,,
-jingSchoolofChineseMedicineNanyangInstituteofTechnologyNanyangHenan473004China
,
-jingFormulaeandHerbsforImmunoregulationNanyangInstituteof
,,
TechnologyNanyangHenan473004China
AbstractAimTostudytheeffectofWenyangHua-Nrp1signalingpathwayinsystemicsclerosisSSc
,
zhuoTongluoformulaWYHZTLFontheSema3A/mousemodelandtoexploreitsmechanisminthe
中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2022Jul3871093~9·1093·
七福饮调控JAK2/STAT3通路改善2型糖尿病
认知障碍的效应与机制
刘玲,张静文,张瑞华,史磊,王晨,韩朝军,史永恒,王斌,刘继平
陕西中医药大学科,陕西咸阳712000
小胶质细胞,降低和
-α、IL-6、p-JAK2/JAK2p-STAT3/
水平,升高和含量具有改
文献标志码A文章编号1001-1978202207-1093-06STAT3IL-10BDNF。结论QFY
善型糖尿病认知障碍的作用,其机制可能与抑制血糖上
中国图书分类号R-
升,调控通路抑制小胶质细胞活化有关
。
摘要目的研究七福饮QFY对2型糖尿病认知障碍大鼠
关键词七福饮型糖尿病认知障碍小胶质细胞炎症因
JAK2/STAT3通路的调控作用。方法采用小剂量STZ联2
,子通路
合高脂高糖饲料喂养的方法造模成功后分成模型组、QFYJAK2/STAT3
,
低、高剂量组、二甲双胍组。干预4周后检测空腹血糖
水迷宫检测大鼠空间学****记忆能力尼氏染色和免疫
Morris开放科学资源服务标识码OSID
荧光染色检测大脑损伤程度以及小胶质细胞标志物Iba-1的
表达检测和的表达
ELISATN